Alternativa in vitro para la evaluación de la reactogenicidad de vacunas basadas en vesículas de membrana externa

Jan 19, 2024

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12675 (2023) Citar este artículo

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Las moléculas activadoras inmunitarias intrínsecas o añadidas son clave para que la mayoría de las vacunas proporcionen los perfiles de inmunidad deseados, pero pueden aumentar la reactogenicidad sistémica. Las agencias reguladoras exigen pruebas de pirógenos en conejos (RPT) para demostrar la reactogenicidad de la vacuna. Recientemente, la prueba de activación de monocitos (MAT) ganó popularidad como alternativa in vitro, aunque este ensayo se diseñó principalmente para probar productos libres de pirógenos. El objetivo era ajustar el MAT para permitir la prueba de vacunas que contienen pirógenos en una etapa temprana de desarrollo donde aún no hay ningún lote de referencia disponible. Se compararon MAT y RPT para evaluar perfiles de seguridad desconocidos de candidatas a vacuna de vesícula de membrana externa (OMV) contra la tos ferina con los de Bexsero como vacuna de referencia sustituta. Los OMV contra la tos ferina con LPS de tipo salvaje activaron predominantemente TLR2 y TLR4 y fueron más reactógenos que Bexsero. Sin embargo, este perfil de reactogenicidad para las OMV contra la tos ferina podría igualarse o reducirse drásticamente en comparación con Bexsero o una vacuna contra la tos ferina de células completas, respectivamente, mediante el cambio de dosis, la modificación del LPS, la administración intranasal o una combinación de estas. Es importante destacar que, a excepción de los productos modificados con LPS, los perfiles de reactogenicidad obtenidos con RPT y MAT fueron comparables. En general, demostramos que esta vacuna candidata OMV contra la tos ferina tiene un perfil de seguridad aceptable. Además, el MAT demostró su aplicabilidad para evaluar los niveles de reactogenicidad de vacunas que contienen pirógenos en múltiples etapas del desarrollo de la vacuna y podría eventualmente reemplazar las pruebas de pirógenos en conejos.

La reactogenicidad sistémica después de la inmunización es un efecto adverso comúnmente observado y monitoreado. La reactogenicidad es causada por patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) que están presentes en la vacuna. Mientras que algunas vacunas están diseñadas para estar completamente libres de PAMP para minimizar la reactogenicidad sistémica, otros diseños de vacunas utilizan el efecto adyuvante de PAMP intrínsecos o añadidos para dirigir las respuestas inmunitarias hacia un perfil inmunitario específico1. Las vesículas de membrana externa (OMV) son pequeñas partículas que se desprenden de la membrana externa de las bacterias Gram-negativas y, por lo tanto, contienen PAMP intrínsecos como los lipopolisacáridos (LPS) y las lipoproteínas2. Durante las últimas décadas, las OMV se han implementado en vacunas desarrolladas contra diferentes especies bacterianas, como Bordetella pertussis (B. pertussis), Neisseria meningitidis serogrupo B (NmB), Neisseria gonorrhoeae (Ng) y Shigella3,4,5,6,7 . Además, las OMV se pueden aplicar como vehículo y adyuvante para vacunas proteicas contra, es decir, infecciones virales, como el SARS-CoV-28. La composición de los PAMP en las OMV y, por tanto, el perfil de reactogenicidad, puede diferir como resultado de especies seleccionadas, procesos de producción o modificaciones genéticas9. Por lo tanto, la capacidad de evaluar la reactogenicidad sistémica en una etapa temprana del desarrollo de la vacuna es clave para diseñar vacunas que contengan pirógenos con un perfil equilibrado de alta inmunogenicidad y reactogenicidad aceptable.

Todos los productos parenterales, incluidas las vacunas OMV, deben someterse a pruebas de contenido de pirógenos/endotoxinas para garantizar un perfil de seguridad aceptable. Actualmente existen varios métodos para realizar pruebas de pirógenos/endotoxinas. La prueba de endotoxinas bacterianas (BET) sólo puede detectar endotoxinas y, por lo tanto, no detectaría otros pirógenos presentes en las OMV, por ejemplo, las lipoproteínas. El otro método es la prueba de pirógenos en conejos (RPT), que puede detectar pirógenos endotoxinas y no endotoxinas. Sin embargo, el RPT se modifica para analizar las vacunas pirógenas inherentes (por ejemplo, el producto se diluye antes de la inyección intravenosa o, en cambio, se inyecta por vía intramuscular)10. Además, estudios recientes demostraron que el RPT puede ser menos sensible a las endotoxinas de lo que se supone, lo que probablemente depende del tipo de raza de conejo y de la cepa utilizada11. El método más reciente para detectar pirógenos es la prueba de activación de monocitos (MAT), que puede detectar todos los pirógenos y no sólo las endotoxinas, como es el caso del BET. Además, el MAT refleja mejor el sistema inmunológico humano ya que utiliza monocitos humanos en lugar de los del sistema inmunológico de conejo. Para los medicamentos parenterales, el MAT es un método recomendado en la Farmacopea Europea (Ph. Eur.) y la Comisión de la UE lo considera el método de reemplazo preferido del RPT para cumplir con el principio de las 3R de reemplazo, reducción y refinamiento y los objetivos de sostenibilidad12 .

Para las vacunas que contienen PAMP intrínsecos o añadidos, se requiere un delicado equilibrio entre seguridad e inmunogenicidad; demasiada reactogenicidad conducirá a más efectos secundarios (graves) y muy poca reactogenicidad o estimulación conducirá a una eficacia (inmunidad) reducida o nula. El MAT se puede utilizar para evaluar este nivel de reactogenicidad y actualmente se utiliza como prueba de seguridad y consistencia para Bexsero en el momento del lanzamiento13. Para probar vacunas basadas en OMV que se encuentran en fase de desarrollo, el MAT requirió optimización para poder evaluar la reactogenicidad de estas OMV con un único procedimiento MAT general. Este estudio describe los resultados del proceso de optimización y las pruebas MAT de varios OMV de diferentes especies bacterianas. El formato MAT utilizado fue una comparación de lotes de referencia, que está en línea con la actual Ph. Eur. capítulo 2.6.30 (07/2017). Para comparar lotes de referencia, se debe utilizar un lote de referencia conocido y justificado. Sin embargo, dado que nuestros OMV aún se encuentran en fase de desarrollo, no es sencillo indicar un lote de referencia. Por lo tanto, se eligió Bexsero como vacuna sustituta de referencia, ya que esta vacuna basada en OMV tiene un perfil de seguridad aceptado y los datos MAT obtenidos con Bexsero están disponibles en la literatura13,14,15. Finalmente, se desentrañaron los perfiles de seguridad desconocidos de una selección de vacunas candidatas contra la tos ferina OMV y se compararon cara a cara en el MAT y el RPT, lo que demuestra que el MAT también se puede aplicar en esta fase temprana del desarrollo de la vacuna.

Todos los OMV se produjeron utilizando un proceso de producción de plataforma reducido desarrollado en Intravacc16 con un método de extracción con EDTA y algunos pasos de optimización según el tipo de OMV y la especie. Se incluyeron dos tipos de OMV contra B. pertussis, ya sea derivados de la cepa B1917 (que contiene LPS no modificado) (denominada en adelante omvPV(WT LPS)) o una cepa con una modificación LpxA en LPS17 (denominada en adelante omvPV(LpxA)). No se pudieron revelar detalles sobre los tres procesos de producción diferentes que se utilizaron para producir omvPV(LPS) con mayor rendimiento y pureza. La vacuna meningocócica OMV se aisló de una cepa no encapsulada de Neisseria (N.) meningitidis serogrupo B H44/76 con una modificación Lpxl118 (denominada en adelante omvNmB(Lpxl1)). La cepa MS11 de Neisseria gonorrhoeae con una modificación Lpxl1 añadida se utilizó para producir la vacuna gonocócica OMV (denominada en adelante omvNg(Lpxl1)). La concentración de proteína total se determinó utilizando un método BCA (Kit de ensayo de proteínas Micro BCA™, Thermo Fisher) que se utilizó como dosis de vacuna estándar para todas las OMV, a menos que se indique lo contrario. El control de calidad estándar de las OMV basado en el tamaño de las partículas, la composición de proteínas y el contenido de LPS se realizó como se describió anteriormente19, pero no se incluyeron datos. La estructura de OMV se investigó previamente utilizando TEM20.

El LPS se aisló a partir de lisado de B. pertussis inactivado por calor utilizando un método de extracción con agua y fenol caliente21. La concentración de LPS se determinó analizando la composición de ácidos grasos con un método de cromatografía de gases22. Se usó un peso molecular de 4057 g/mol o 4001 g/mol para calcular las concentraciones de LPS para WT LPS o LpxA, respectivamente.

Bexsero (GSK) y aPV (Daptacel DTaP, Sanofi Pasteur) se obtuvieron de la farmacia internacional. La vacuna contra la tos ferina de células enteras (wPV) (Estándar internacional de la OMS contra la tos ferina (células enteras) (94/532)23 se obtuvo del Instituto Nacional de Estándares y Control Biológicos (NIBSC, Inglaterra).

El MAT se realizó utilizando el MAT Cell Set (Sanquin Reagents, Amsterdam, Países Bajos), siguiendo las instrucciones del fabricante con las adaptaciones descritas. En resumen, las preparaciones de OMV se diluyeron en medio completo (medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM; Lonza, Verviers, Bélgica) suplementado con 5% de suero fetal bovino (FBS) o 5% de suero humano (HS) (ambos de Biowest, Nuaillé, Francia) como fuente de suero) y se agregaron 100 µL a los pocillos de una placa de 96 pocillos. Cada dilución de muestra se probó por duplicado, triplicado o cuadruplicado como se indica en cada figura. Posteriormente, se descongeló un vial que contenía 5 × 106 (± 1 × 106) PBMC criopreservadas (1 ml) en un baño de agua a 37 °C hasta que quedó un pequeño trozo de hielo. Posteriormente, la suspensión celular se transfirió a un tubo nuevo y se diluyó con 10 ml de medio completo. En la placa de cultivo celular MAT, se agregaron 100 µl de células a 100 µl de muestra. Posteriormente, la placa de cultivo celular de 96 pocillos se incubó en una incubadora humidificada a 37 °C en presencia de 5% de CO2 durante 18 a 24 h, con aproximadamente 45.000 células/pocillo. En este estudio se utilizaron diferentes lotes de PBMC criopreservadas (cada una con 4 donantes diferentes), preparaciones de HS y OMV.

Después de la incubación durante la noche, los sobrenadantes del cultivo celular se recogieron y se analizaron en una dilución 1:5 para determinar la presencia de IL-6 usando un kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) disponible comercialmente (kit ELISA de IL-6 humana PeliKine Compact, Sanquin, Ámsterdam). , Países Bajos) combinados con tampones y reactivos ELISA adicionales (PeliKine Toolset 1, Sanquin, Ámsterdam, Países Bajos) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se muestra la densidad óptica (OD) a 450 nm con la resta de la OD de fondo a 550 nm.

Todas las líneas celulares utilizadas se obtuvieron de Invivogen (Francia). Se estudiaron HEK-Blue hTLR2, HEK-Blue hTLR3, HEK-Blue hTLR4, HEK-Blue hTLR7, HEK-Blue hTLR9, HEK-Blue hNOD1, HEK-Blue hNOD2 así como líneas celulares de control HEK-Blue Null1 y HEK-Blue Null2. cultivado (37 °C, 5 % CO2) en medio Eagles modificado de Dulbecco (DMEM) (Gibco) suplementado con 100 µg/ml de normicina (Invivogen), 100 unidades de penicilina, 100 unidades de estreptomicina, 2,92 mg/ml de L-glutamina (Gibco) , 10% de FBS inactivado por calor (Gibco) y antibióticos selectivos de líneas celulares específicas (Invivogen) en un matraz T75. Cuando se logró una confluencia del 70 al 80%, las células HEK-Blue se separaron de los matraces de cultivo utilizando PBS (Gibco) y se subcultivaron. Cuando se logró el pase 20, se descartaron las células.

Las células HEK-Blue se sembraron en placas de 96 pocillos (de fondo plano) a 50.000 células viables en 100 µl de medio por pocillo y se cultivaron durante la noche (37 °C, 5 % de CO2). Las células se estimularon al día siguiente con 100 µl de OMV comenzando a 2 µg/ml en diluciones en serie de cinco veces y antagonistas de TLR/NOD como controles positivos. Posteriormente, las placas se incubaron durante 24 h (37 °C, 5% CO2). A continuación, se transfirieron 20 µl de sobrenadante de cultivo de cada pocillo a pocillos de una placa de 96 pocillos que contenía 180 µl de reactivo de detección Quanti-Blue precalentado. La absorbancia se leyó después de 1 hora a 630 nm con un lector de microplacas (Bio-Tek). La activación de TLR se determinó calculando el cambio en las células no estimuladas.

Se incluyeron 50 conejas sanas (exógamas/blancas de Nueva Zelanda) de 10 a 13 semanas de edad para la prueba de pirógenos en conejos realizada en un CRO (Charles River Laboratories Ireland Ltd., Irlanda). El plan de estudio fue revisado y aprobado por el Comité de Ética de Charles River Laboratories Ireland Ltd. Los experimentos con animales se realizaron de conformidad con la Directiva europea para la protección de los animales utilizados con fines científicos, Directiva 2010/63/UE, transpuesta al irlandés. ley bajo el Instrumento Estatutario SI No 543 de 2012 y lineamientos ARRIVE. Después de 3 días de aclimatación, a cada animal se le implantó quirúrgicamente un chip de telemetría de temperatura bajo anestesia (anestesia inyectable en forma de medetomidina (Medetor 1 mg/ml) a 0,25 mg/kg, ketamina (Narketan 100 mg/ml) a 15 mg/kg. y Meloxicam (Metacam 2 mg/ml) a 1,0 mg/kg) en la cavidad abdominal (intraperitoneal). La temperatura inicial de cada conejo se determinó durante un período de 5 días consecutivos (del día del estudio - 5 al día del estudio 0) y debía estar dentro de los límites normales (38 a 40 °C). Los conejos se distribuyeron aleatoriamente en 10 grupos (n = 5 por grupo) y se alojaron juntos en una jaula con 5 conejos por corral. El día de estudio 0, se inmunizaron 7 grupos (35 animales) con 0,5 ml (0,25 ml en dos sitios separados) del artículo de prueba por vía intramuscular. Grupo 1: 50 µg omvPV(WT LPS), Grupo 2: 10 µg omvPV(WT LPS), Grupo 3: 50 µg omvPV(LpxA), Grupo 4: 10 µg omvPV(LpxA), Grupo 5: 1 dosis de Bexsero, Grupo 6: 1 dosis wPV o Grupo 7: placebo. Además, se inmunizaron 3 grupos (15 animales) por vía intranasal bajo anestesia (como se describió anteriormente) con 0,1 ml (0,05 ml por fosa nasal) del artículo de prueba. Grupo 8: 50 µg de omvPV (WT LPS), Grupo 9: 50 µg de omvPV (LpxA) o Grupo 10: placebo. Posteriormente se controló la temperatura de los 50 conejos durante un período de 30 h. De acuerdo con ARRIVE, los animales fueron excluidos del estudio si mostraban efectos adversos inaceptables después de la cirugía o como resultado de la inmunización, por ejemplo, signos visibles de angustia, rechazo de alimentos y/o agua o infección. Un veterinario evaluaría si estos animales podrían ser tratados o, si fuera necesario, sacrificados humanamente. En general, no fue necesario excluir animales ni puntos de datos.

Los niveles de anticuerpos IgG anti-tos ferina en diferentes lotes de HS se determinaron mediante un inmunoensayo múltiple como se describió anteriormente24. En total, se determinaron los niveles de anticuerpos IgG contra seis antígenos de tos ferina purificados, a saber, resistencia a la muerte de Bordetella (BrkA), fimbrias 2/3 (Fim2/3), hemaglutinina filamentosa (FHA), pertactina (Prn), toxina de tos ferina (Ptx) y virulencia. gen asociado 8 (Vag8). Además, se incluyeron vesículas de membrana externa derivadas de la cepa B1917 para determinar una gama más amplia de antígenos, ya que estas vesículas contienen múltiples antígenos de tos ferina.

Se utilizó GraphPad Prism 9.1.1 para trazar las DO frente a la dilución para la representación gráfica de los datos; para determinar el área bajo la curva (AUC) y calcular los valores p. Las AUC se representan como media ± DE. Los valores de p para MAT se calcularon con la prueba ANOVA de Brown-Forsythe y Welch para comparación múltiple, que supone diferentes DE entre grupos; ya que las SD de omvPV (WT LPS y LpxA) y Bexsero eran diferentes. Los datos del RPT se analizaron con ANOVA estándar para comparación múltiple.

Para la optimización del MAT se utilizó una vacuna OMV contra B. pertussis (omvPV(WT LPS)) que aún se encontraba en desarrollo temprano con respecto a dosificación, proceso de producción y modificación al LPS. Se utilizó una dosis estimada de 100 µg/ml de contenido de proteína total en la OMV como dosis inicial basada en datos de inmunogenicidad en ratones25. Se utilizó Bexsero (vacuna basada en OMV contra Neisseria meningitidis serogrupo B (NmB)) como producto de referencia ya que la vacuna omvPV (WT LPS) aún estaba en desarrollo y, por lo tanto, aún no estaba disponible un lote de referencia. Las PBMC utilizadas en este estudio procedían de un kit comercial (MAT Cell Set) y este kit contiene PBMC combinadas criopreservadas de 4 donantes diferentes y las PBMC se examinaron previamente para garantizar la reactividad a 5 pirógenos diferentes, específicamente HKSA (TLR 2), FLA. -ST (TLR5), PAM3CSK4 (TLR2/1), PGN (Nod2) y endotoxina (TLR4).

El MAT basado en PBMC requiere la adición de suero al medio. Para esto se pueden utilizar tanto suero bovino fetal (FBS) como suero humano (HS) y, por lo tanto, ambos se compararon al evaluar la reactogenicidad de omvPV (WT LPS) y Bexsero. Se probaron once diluciones cuádruples de omvPV (WT LPS) y Bexsero para evaluar el rango y la fuente de suero más óptimos para el MAT. Las diluciones de las muestras analizadas oscilaron entre 800x – 838.860.800x (correspondiente a 1.600x – 1.677.721.600 × dilución en el pocillo). Para omvPV (WT LPS) no se observaron diferencias significativas entre los valores del área bajo la curva (AUC) de MAT basado en FBS y HS (valor de p = 0,125) (Fig. 1). Además, la reactogenicidad observada de Bexsero también fue comparable entre MAT basado en FBS y HS (valor de p 0,306). La reactogenicidad de omvPV (WT LPS) y Bexsero fue significativamente diferente (p <0,05) tanto en MAT basado en FBS como en HS. Bexsero es menos reactivo que la dosis probada de 100 µg/ml de omvPV (WT LPS) (Fig. 1), ya que las respuestas de IL-6 de Bexsero comienzan a disminuir a partir de una dilución de 3200 × en adelante, mientras que para omvPV (WT LPS) esto ocurre a partir de la dilución. 819.200 × en adelante. En general, no se observaron diferencias significativas entre el MAT basado en FBS y HS. Por lo tanto, se decidió continuar con MAT basado en HS, ya que refleja mejor el sistema inmunológico humano y está en línea con el principio de las 3R.

Comparación de HS y FBS en MAT. Las respuestas de IL-6 se compararon cuando las PBMC se estimularon con diferentes diluciones (concentraciones) de omvPV (WT LPS) y Bexsero usando HS o FBS como fuente de suero y se expresan como densidad óptica (OD, gráfico izquierdo) y como área bajo el curva (AUC) de las curvas OD (gráfico derecho). El omvPV (WT LPS) sin diluir contenía 100 μg/ml de OMV y Bexsero contenía 50 μg/ml de OMV. Después de una incubación durante la noche, se realizó el ELISA de IL-6 en sobrenadantes de cultivo diluidos 1:5. Cada muestra fué examinada doble. El AUC de las curvas ajustadas se representa como media ± desviación estándar (DE). *p < 0,05, **p < 0,01.

Para determinar la solidez del MAT basado en HS, se probaron dos lotes de HS adicionales. Estos lotes mostraron respuestas de IL-6 comparables a las respuestas obtenidas con el primer lote de HS (lote 1; igual que en la Fig. 1) (Fig. 2A). El lote 2 de HS dio respuestas de IL-6 significativamente más bajas que el lote 1 o 3 para omvPV (WT LPS) (el valor de p es 0,018). El uso de HS en el MAT podría reflejar mejor la situación real tras la inmunización en humanos. Sin embargo, dependiendo del antígeno, las inmunizaciones previas y/o infecciones naturales que ocurrieron en el/los donante/s podrían provocar la presencia de anticuerpos en la fuente de suero humano que pueden afectar los resultados del MAT. Especialmente para B. pertussis, se sabe que la mayoría de los individuos tienen un cierto nivel y diversidad de anticuerpos anti-tos ferina24, mientras que la presencia de anticuerpos anti-NmB es menos probable (excepto después de la inmunización con Bexsero). Para ello se decidió determinar la presencia de diferentes anticuerpos anti-tos ferina en los tres lotes de HS utilizando un panel de antígenos disponible (Fig. 2B). En primer lugar, estos resultados indicaron que los tres lotes de HS efectivamente contenían anticuerpos contra la tos ferina contra todos los antígenos analizados. En segundo lugar, se observó que los niveles de anticuerpos diferían entre los tres lotes. Esto indica que HS contendrá anticuerpos contra la tos ferina y que cada lote varía.

Robustez de MAT basado en HS utilizando omvPV (WT LPS) y Bexsero. La solidez del MAT basado en HS para omvPV (WT LPS) se evaluó con diferentes lotes de HS, PBMC y procesos de producción. (a) Las respuestas de IL-6 se compararon utilizando 3 lotes HS diferentes combinados con el lote n.º A de PBMC y se expresan como densidad óptica (OD) y como área bajo la curva (AUC) de las curvas OD. Cada muestra se probó por duplicado. (b) Se determinaron los niveles de anticuerpos inmunoglobulina G (IgG) dirigidos contra Ptx, Prn, FHA, Fim2/3, BrkA, Vag8 y OMV en 3 lotes de HS diferentes. Los resultados se expresan como intensidades de fluorescencia (FI). (c) Las respuestas de IL-6 se compararon utilizando 3 lotes de PBMC diferentes combinados con el lote de HS nº 1. (d) Se compararon las respuestas de IL-6 de 3 lotes diferentes de Bexsero. (e) Se compararon las respuestas de IL-6 de 3 procesos de producción de omvPV (WT LPS) diferentes. El área bajo la curva (AUC) de las curvas ajustadas se determinó y se representó como media ± desviación estándar (DE). *p < 0,05, **p < 0,01, a: significativamente menor que el omvPV del lote 1 (WT LPS), b: significativamente menor que el omvPV del lote 2 (WT LPS), c: significativamente menor que el omvPV del lote 3 (WT LPS).

Posteriormente, se investigó la solidez del MAT comparando tres lotes diferentes de PBMC combinadas criopreservadas; cada lote contiene PBMC de 4 donantes diferentes. Las curvas de respuesta de IL-6 de los dos lotes de PBMC adicionales fueron similares a las del lote A (lote A; igual que en la Fig. 1) (Fig. 2C). No hubo diferencias significativas entre los lotes A, B y C de PBMC dentro de un grupo de muestra (Bexsero u omvPV(WT LPS)), solo diferencias significativas entre los grupos de muestra. Finalmente, se determinó la variedad de tres lotes de la vacuna de referencia Bexsero. Aquí, el lote 2 mostró una reactogenicidad comparable a la del lote 1, mientras que el lote 3 tuvo una reactogenicidad menor (Fig. 2D).

En esta etapa, no se pudo realizar robustez en tres lotes idénticos de OMV de tos ferina ya que la optimización del proceso de producción aún estaba en curso. Por lo tanto, como alternativa, se utilizó el ensayo MAT para probar productos de omvPV obtenidos con tres procesos de producción diferentes que apuntaban a una mayor pureza y rendimiento de OMV. Estos resultados revelaron que el proceso de producción puede afectar la reactogenicidad ya que el omvPV del proceso 1 fue el más reactógeno, mientras que el proceso 3 resultó en la reactogenicidad más baja (Fig. 2E), lo que indica que el MAT también se puede utilizar en esta etapa del desarrollo de la vacuna.

El MAT desarrollado se aplicó para probar y comparar la reactogenicidad de las vacunas OMV dirigidas a diferentes especies bacterianas que se encuentran en diversas etapas de desarrollo (Fig. 3). Además de la omvPV (WT LPS), utilizada para la optimización de MAT, se incluyeron las vacunas OMV contra Neisseria meningitis subclase B (omvNmB(Lpxl1)) y Neisseria gonorrhoeae (omvNg(Lpxl1)). Ambos fueron aislados de cepas con una estructura de LPS modificada para reducir la reactogenicidad. Para todas las vacunas OMV, se utilizó 100 µg/ml de proteína como dosis inicial estimada. Este experimento demostró que de todos estos productos el omvPV(WT LPS) tenía de hecho el perfil de reactogenicidad más alto en el MAT. Tanto omvNmB(Lpxl1) como omvNg(Lpxl1) a 100 µg/ml revelaron un perfil de reactogenicidad similar o incluso menor en comparación con Bexsero. Sorprendentemente, la forma de las curvas de respuesta de IL-6 fue similar para las OMV de diferentes especies bacterianas, mientras que la composición y estructuras de las PAMP pueden diferir entre especies. En general, estos resultados indicaron que el MAT optimizado era aplicable para probar múltiples vacunas que contienen OMV.

Reactogenicidad hacia OMV de diferentes especies bacterianas. Las respuestas de IL-6 se compararon para diferentes diluciones de productos de omvNmB(Lpxl1), omvNg(Lpxl1) y omvPV(WT LPS), todas ellas establecidas en 100 μg/ml de proteína y se expresan como OD (gráfico izquierdo) y AUC de las curvas OD (gráfico derecho). Además, se utilizó Bexsero en dosis humana y contenía 50 μg/ml de OMV (en 0,5 ml). El AUC se representa como media ± desviación estándar. *p < 0,05, **p < 0,01.

Después de los estudios iniciales de optimización de MAT, omvPV estuvo disponible con un LPS omvPV(LpxA) modificado. Por lo tanto, se podría hacer una comparación directa entre omvPV(WT LPS) y omvPV(LpxA). Además, decidimos aislar LPS de ambas cepas para determinar únicamente el efecto de la modificación de LPS en el MAT. Al dosificar las OMV según el contenido de LPS en lugar de la concentración de proteína, se podría hacer una comparación con el LPS purificado para evaluar la contribución del LPS a la reactogenicidad en las OMV y si otros PAMP pueden desempeñar un papel.

La modificación de LpxA en el LPS redujo claramente la reactogenicidad de la muestra de LPS purificada ya que el aislado de LpxA indujo una menor producción de IL-6 en comparación con el aislado de LPS WT (Fig. 4A). Sin embargo, la forma de la curva de respuesta de IL-6 del aislado de LPS WT sugiere que todavía hay otros PAMP presentes en la preparación de LPS, ya que esta curva no tenía una forma de S estándar como se esperaba para LPS. Esto podría deberse a los materiales libres de pirógenos utilizados durante el procedimiento de aislamiento de LPS o a que algunos pirógenos no endotoxinas (NEP) de B. pertussis se purificaron junto con LPS.

Contribución de LPS y otros PAMP en la reactogenicidad de las OMV de tos ferina. (a) Las respuestas de IL-6 de las PBMC se compararon después de la estimulación con OMV y LPS aislado de cepas omvPV (WT LPS) y omvPV (LpxA). Se aislaron 100 μg/ml de LPS WT y LPS desintoxicado (LpxA) de cepas representativas de B. pertussis, y esto se comparó con omvPV(WT LPS) y omvPV(LpxA), que tenían una concentración de 100 μg/mL de LPS en lugar de 100 μg. /ml de proteína. (b) Se comparó la activación de diferentes PRR por las OMV contra la tos ferina con otras vacunas contra la tos ferina. Se estimularon diferentes líneas celulares informadoras con omvPV (WT LPS), omvPV (LpxA), wPV o aPV por duplicado utilizando un rango de dilución de las vacunas (2 – 0,000128 µg/ml). El área bajo la curva se calculó y se representó como media ± desviación estándar.

Sorprendentemente, el efecto de la modificación del LPS no se observó al comparar tanto el omvPV (WT LPS) como el omvPV (LpxA), ya que ambos productos proporcionaron perfiles de reactogenicidad iguales (Fig. 4A). Es importante destacar que la respuesta de IL-6 a ambos aislados de LPS fue menor que a las dos preparaciones de omvPV en concentraciones iguales de LPS, lo que indicó que la reactogenicidad causada por ambos omvPV no es causada únicamente por la presencia de LPS. Por lo tanto, estos datos indican que las preparaciones de omvPV contienen otras NEP de la bacteria junto al LPS que contribuyen a la reactogenicidad en el MAT basado en HS.

Para determinar qué otros PAMP estaban presentes en los omvPV, probamos la activación de receptores de reconocimiento de patógenos únicos (PRR) utilizando líneas celulares reporteras humanas usando wPV y aPV como control (Fig. 4B y Figura 1 complementaria). Primero, estos experimentos confirmaron que la modificación de LpxA en omvPV (LpxA) resultó en una activación de TLR4 eliminada comparable al nivel inducido por aPV. La activación de TRL4 se observó a un nivel similar después de la estimulación con omvPV (WT LPS) o wPV. La activación de TLR2 fue notablemente alta después de la estimulación con las vacunas OMV y wPV. Además, la activación de TLR2 por omvPV(LpxA) fue mayor en comparación con omvPV(WT LPS) y wPV. Como se esperaba, no se observó activación de TLR2 o 4 después de la estimulación con aPV. Las otras PPR analizadas (TLR3, TLR7, TLR9, NOD1 y NOD2) no fueron activadas por ninguna de las vacunas, excepto por una activación menor de NOD2 por wPV. En general, podemos concluir que los OMV y wPV de tos ferina causan la activación de TLR2 debido al contenido de lipoproteínas junto a la activación de TRL4 por LPS. La activación de TLR2 por omvPV parece incluso la única activación de PRR restante, de los PRR probados, cuando se elimina la activación de TLR4.

Finalmente, las dos variantes de omvPV se compararon en diferentes dosis con diferentes vacunas de referencia (Bexsero y wPV) utilizando tanto el MAT como el RPT para salvar las diferencias en especies (humana versus conejo), así como resultados in vivo e in vitro. Para MAT y RPT se utilizaron las mismas muestras. En el MAT se utilizaron concentraciones iniciales de 100 µg/ml o 20 µg/ml de proteína total para omvPV(WT LPS) y omvPV(LpxA), mientras que se inyectaron 0,5 ml de estas soluciones por vía intramuscular (im) en el RPT, lo que dio como resultado una dosis de 50 µg o 10 µg por conejo, respectivamente.

En primer lugar, se determinó la pirogenicidad in vitro en el MAT. Aquí, se comparó la inducción de IL-6 de dos concentraciones diferentes (100 o 20 µg/mL) de omvPV(LpxA) y omvPV(WT LPS) con la inducida por placebo (NaCl), wPV (estándar de la OMS) y Bexsero (Fig. 5A). Los resultados mostraron que todas las vacunas indujeron más IL-6 en comparación con la solución salina. El wPV indujo el nivel más alto de IL-6. Las concentraciones de 100 µg/ml tanto de omvPV(LpxA) como de omvPV(WT LPS) fueron menos pirógenas en comparación con wPV pero más pirógenas en comparación con Bexsero. Las concentraciones de 20 µg/ml tanto de omvPV(LpxA) como de omvPV(WT LPS) fueron menos pirogénicas en comparación con Bexsero. Sorprendentemente, aunque también se observó en el experimento anterior, el omvPV(WT LPS) parecía menos pirógeno en comparación con el omvPV(LpxA) para ambas dosis.

Comparación de la pirogenicidad de las OMV de tos ferina después de la modificación de LPS o el cambio en la dosificación en MAT y RPT. (a) Comparación de dos dosis diferentes (dosis 1 = 50 µg, dosis 2 = 10 µg) de omvPV (LpxA) y omvPV (WT LPS) con placebo (NaCl), wPV (estándar de la OMS) y Bexsero en MAT. Los resultados que representan la concentración de IL-6 se representan como DO 450–550 nm en un rango de dilución o como AUC por grupo con SD. (b) Fluctuaciones de temperatura en conejos medidas cada hora durante un período de 30 h después de la inmunización en comparación con la temperatura antes de la inmunización. (c) Se calculó el área bajo la curva (AUC) desde t = 0 (inmunización) hasta 30 h después de la inmunización. *Significativamente más alto que el control salino; a - significativamente menor en comparación con 50 µg de omvPV (WT LPS); b: significativamente menor en comparación con 10 µg de omvPV (WT LPS); c: significativamente menor en comparación con wPV. Para cada grupo, se representan la media y la DE, así como los datos de cada conejo individual (N = 5 por grupo). (d) Correlación entre MAT y RPT. Los resultados del AUC del MAT se compararon con los resultados del AUC del RPT (solo administración im). Los diferentes grupos se presentan como omvPV(WT LPS), omvPV(LpxA), Bexsero y wPV, solución salina incluida una línea de regresión con R = 0,75 y R2 = 0,56.

En segundo lugar, para el estudio de pirogenicidad en conejos se eligió una configuración experimental similar a la realizada en el MAT. Los conejos recibieron 50 o 10 µg de omvPV (WT LPS) u omvPV (LpxA) im y la temperatura corporal se comparó con la de los conejos tratados con placebo (NaCl), wPV y Bexsero. La temperatura corporal después de la inmunización se corrigió según la temperatura corporal basal medida durante los 5 días anteriores a la inmunización. Posteriormente, se controlaron las fluctuaciones de temperatura durante un período de 30 h (Fig. 5B), se determinó el aumento máximo de la temperatura corporal después de la inmunización (Figura 2 complementaria) y se calculó el AUC de la temperatura corporal corregida después de la inmunización para cada conejo (Fig. 5C).

Es importante destacar que la administración im de omvPV(LpxA) con dosis de 50 µg y 10 µg dio como resultado un aumento máximo de temperatura corporal significativamente menor y un AUC más pequeño en comparación con omvPV(WT LPS) (Fig. 5C y Figura complementaria 2), que indica que la modificación del LPS conduce a un perfil de reactogenicidad más seguro para el omvPV en conejos. Se observó un efecto dosis-respuesta cuando se compararon 50 µg de omvPV(LpxA) con 10 µg de omvPV(LpxA). La dosis baja indujo un aumento significativamente menor en la temperatura corporal máxima (p = 0,003) y el AUC (p <0,001). Además, el AUC fue menor después de la inmunización con 50 µg o 10 µg de omvPV(LpxA) en comparación con la inmunización con wPV. Sin embargo, el aumento máximo de la temperatura corporal no difirió entre la dosis de 50 µg y la wPV. Además, tanto el aumento máximo de temperatura como el AUC fueron mayores para 50 µg de omvPV(LpxA) en comparación con la administración im salina. Sorprendentemente, la dosis de 10 µg de omvPV(LpxA) no difirió del grupo de solución salina en términos de aumento máximo de temperatura y AUC.

Para omvPV (WT LPS), tanto la dosis alta como la baja indujeron un aumento máximo de la temperatura corporal máxima y un AUC mayor en comparación con el grupo de solución salina (Fig. 5B, C y Figura 2 complementaria). Cuando se compararon el efecto de la dosis de 50 µg y 10 µg de omvPV (WT LPS), la dosis baja resultó en un aumento significativamente menor en la temperatura corporal máxima (p = 0,02) y el AUC (p < 0,001). La comparación de 50 µg im de omvPV (WT LPS) con wPV mostró que ambas vacunas indujeron un aumento máximo de temperatura corporal similar, pero el AUC fue mayor después de la inmunización con omvPV (WT LPS). Además, se encontró un aumento máximo comparable de la temperatura corporal después de la administración de 10 µg de omvPV (WT LPS); sin embargo, en esta dosis el AUC de omvPV (WT LPS) fue menor en comparación con wPV. Finalmente, Bexsero indujo un ligero aumento en la temperatura corporal máxima, pero el AUC no difirió significativamente del control de solución salina. En resumen, ambas dosis de omvPV(WT LPS) y wPV, así como la dosis de 50 µg de omvPV(LpxA), indujeron un mayor aumento de la temperatura corporal (tanto en el aumento máximo como en el AUC) en comparación con Bexsero cuando se administró por vía intramuscular en conejos.

Además de la inmunización intramuscular, también evaluamos la administración intranasal (in) para ambas omvPV, ya que previamente revelamos que esta ruta de inmunización proporcionó perfiles inmunogénicos y protectores aún más prometedores en comparación con la inmunización sistémica con OMV contra la tos ferina26. Sorprendentemente, después de la inmunización intranasal, a diferencia de la inmunización, no se observó ningún aumento de temperatura ni diferencias entre los grupos (Fig. 5B, C y Figura complementaria 2). Cabe destacar que durante aproximadamente las primeras 10 h la temperatura disminuyó, lo que podría ser resultado de que la anestesia solo se aplicó en la administración (Fig. 5B). En general, estos resultados demuestran que es posible obtener el perfil de seguridad deseado en conejos con omvPV. Para la inmunización intramuscular, se requiere la modificación de LPS y una dosificación más baja, mientras que la vía intranasal puede permitir una dosificación más alta y/o no necesita una modificación de LPS.

Finalmente, se determinó la correlación entre los resultados del AUC del MAT y del RPT (administración im), ya que en ambas pruebas se probaron los mismos productos. El análisis de correlación mostró una correlación positiva (r = 0,75, valor de p = 0,05) entre el AUC del MAT y el AUC del RPT (Fig. 5D). Además, cuando se comparó la disminución de la temperatura y la reactogenicidad de MAT entre 100 y 20 µg/mL (correspondientes a 50 y 10 µg/conejo) para omvPV(WT LPS) y omvPV(LpxA), las disminuciones parecen ser paralelas entre sí. , lo que confirma una buena correlación entre los resultados de MAT y RPT para diferentes omvPV. En general, esto muestra que los resultados de las pruebas in vitro e in vivo fueron comparables y que el MAT puede servir como una alternativa in vitro para evaluar la reactogenicidad de las vacunas basadas en OMV.

Este estudio demostró que el MAT es robusto y puede usarse para determinar la reactogenicidad en diferentes preparaciones basadas en OMV, incluso aquellas que aún se encuentran en la fase de desarrollo. El método MAT utilizado en este estudio es un método de comparación de lotes de referencia, que es el método preferido para productos pirogénicos inherentes según Ph. Eur. capítulo 2.6.30. Sin embargo, normalmente no hay un lote de referencia disponible para las vacunas en desarrollo inicial y, por lo tanto, se decidió utilizar Bexsero como lote de referencia. Bexsero es una vacuna multicomponente que contiene OMV con un perfil de seguridad comprobado y hay suficiente literatura disponible sobre MAT y Bexsero13,14,15. Los resultados para Bexsero encontrados en este estudio estuvieron en línea con los datos informados por Valentini et al. aunque hubo diferencias en el formato MAT utilizado; Las curvas de IL-6 obtenidas con nuestras PBMC combinadas criopreservadas comenzaron a disminuir a partir de una dilución de 3200x (- 3,5 log) y esto es comparable a los resultados de IL-6 obtenidos por Valentini et al. con donantes individuales criopreservados13. Esto dio confianza en que el MAT era adecuado para su propósito. El MAT se puede realizar con varias fuentes de suero, como FBS o HS. Se probaron ambas fuentes y no se observaron diferencias significativas entre FBS o HS para omvPV (WT LPS) o Bexsero; sin embargo, el ensayo basado en HS pareció responder algo más después de la estimulación con OMV. Probablemente esto se deba a que la OMV consta de múltiples componentes de bacterias Gram-negativas. Resultados anteriores de nuestro laboratorio han demostrado que el MAT basado en FBS es más sensible a la detección de endotoxinas, mientras que el MAT basado en HS es más sensible a los pirógenos no endotoxinas27. Reemplazar FBS con HS también da como resultado un ensayo sin componentes animales. Junto con el hecho de que MAT basado en HS refleja mejor el sistema inmunológico humano, se decidió utilizar MAT basado en HS para realizar pruebas adicionales de MAT con omvPV (WT LPS).

La comparación entre omvPV(WT LPS) dosificado a 100 μg/mL y la dosis humana de Bexsero (que contiene 50 μg/mL de omvNmB, tres antígenos proteicos recombinantes e hidróxido de aluminio) en MAT basado en HS mostró que esta dosis inicial de omvPV(WT LPS) obtenido de estudios con ratones fue mucho más reactivo que Bexsero. Esta diferencia puede deberse a una expresión diferente de PAMP en los productos OMV, ya que derivan de bacterias diferentes. Demostramos que la reactogenicidad de nuestro omvNmB era comparable a la de Bexsero. Además, la presencia de la modificación Lpxl1 presente en Bexsero y omvNmB podría provocar una reactogenicidad reducida28. Además, la presencia de hidróxido de aluminio en Bexsero, que no está presente en omvPV(WT LPS), omvPV(LpxA), omvNg u omvNmB, también puede afectar el nivel de reactogenicidad. La reducción de la dosis de omvPV (WT LPS) a 20 μg/ml dio lugar a respuestas de IL-6 comparables a las de Bexsero.

Hemos demostrado que durante el desarrollo (temprano) de una vacuna basada en OMV, el MAT se puede realizar con un lote de referencia (en este caso Bexsero) que es diferente del producto bajo prueba. Sin embargo, en etapas posteriores, cada tipo de OMV debería obtener su propio lote de referencia en lugar de Bexsero. Porque a menudo un lote de referencia no relacionado produce curvas de IL-6 que no son perfectamente paralelas al lote analizado; o la liberación máxima de IL-6 obtenida con el lote analizado y el de referencia son diferentes. Esto puede crear dificultades al comparar las muestras analizadas con el lote de referencia mediante un ensayo de línea paralela para, por ejemplo, pruebas de consistencia de rutina de los productos. Cuando es necesario determinar un contenido pirogénico para la liberación de un lote, es aún más importante pasar a un lote de referencia que sea similar al producto, ya que es posible que al cambiar de lote HS o PBMC la reactogenicidad de las muestras analizadas, pero no se ve influenciado el del lote de referencia no relacionado o viceversa y esto podría afectar la evaluación del contenido pirógeno.

Este estudio reveló que para la mayoría de los productos el perfil de reactogenicidad obtenido con el RPT podría reflejarse con el MAT, lo que demuestra que este ensayo podría servir como una alternativa para las pruebas con animales. Sin embargo, sorprendentemente, este estudio también demostró que el MAT puede reflejar más fielmente la situación humana in vivo y, por lo tanto, revelar perfiles de reactogenicidad que no habrían sido detectados por el RPT. En este estudio, la reducción esperada en la reactogenicidad de la modificación LpxA en omvPV en comparación con omvPV (WT LPS) no se observó en el MAT, mientras que esta reducción se observó en el RPT. Sin embargo, la LpxA purificada fue menos reactógena en comparación con el LPS WT purificado, lo que demuestra que la modificación del LPS se pudo detectar en el MAT. Esta reactogenicidad reducida de LpxA purificada en comparación con WT LPS se mostró previamente en el RPT17. Ese estudio también mostró que la reactogenicidad de la LpxA purificada estaba en el mismo nivel deseado que la del aPV. La mayor activación de TLR2 por omvPV(LpxA), probablemente debido a una mayor o diferente composición de lipoproteínas en la membrana externa, puede causar una mayor reacción de IL-6 por parte de las PBMC humanas hacia omvPV(LpxA) y potencialmente explicar por qué no se observó diferencia. en el MAT a pesar de la presencia de la modificación LPS. Además, los humanos pueden ser más sensibles a los agonistas de TLR2 en comparación con los conejos, como lo demuestran Schindler et al. para IL-1 en un entorno MAT de sangre total29. La activación de TLR2 y TLR4 mostrada en este estudio por omvPV(WT LPS y omvPV(LpxA) también se observó previamente para vacunas que contienen OMV de NmB después de la administración intramuscular en ratones28.

En este estudio se utilizó una nueva vacuna candidata contra la tos ferina basada en vesículas de membrana externa para optimizar el MAT y compararlo con el RPT. Esta vacuna mejorada contra la tos ferina está diseñada para inducir un perfil de inmunidad más amplio en términos de direccionamiento al antígeno, respuesta de anticuerpos y respuesta de células T3,30 en comparación con el aPV actual19,31. Sin embargo, la vacuna debería tener un perfil de seguridad comparable al de la aPV y, en consecuencia, ser mucho menos reactivo que la actual wPV. El estudio actual demostró por primera vez, tanto con el RPT como con el MAT, que omvPV tiene efectivamente un perfil de seguridad deseado en términos de reactogenicidad sistémica. Esto se logró modificando el LPS, cambiando la dosis, administrando por vía intranasal o una combinación de estos. Es importante destacar que, especialmente con omvPV(LpxA), pero también con omvPV(WT LPS), son posibles diferentes estrategias que dan como resultado un perfil menos reactogénico en comparación con wPV. Este hallazgo está en línea con lo que observamos previamente en nuestro modelo de ratón in vivo, donde la omvPV (WT LPS) indujo respuestas proinflamatorias menos profundas en comparación con la vacuna de células enteras más reactiva, manteniendo el mismo tipo y nivel de inmunidad y protección3. Cabe señalar que el estándar internacional de wPV que se utilizó en este estudio no está adyuvado con alumbre como lo están la mayoría de las vacunas combinadas comerciales que contienen wPV. Sin embargo, la dosis sugerida de 100 µg/ml de proteína total para la inmunización intramuscular con omvPV (WT LPS) es demasiado reactiva en comparación con, por ejemplo, Bexsero; sin embargo, reducir la dosis cinco veces conduce a un perfil de seguridad favorable. Investigaciones futuras deberían confirmar si a esta dosis la inmunogenicidad y la capacidad protectora permanecen intactas. Curiosamente, no se observó fiebre en el RPT para ambos tipos de OMV cuando se administró una dosis alta por vía intranasal; los resultados fueron comparables a los del grupo de solución salina. Una mayor tolerabilidad de la reactogenicidad en las zonas mucosas podría explicar esta observación. Esto puede indicar que para la administración por vía mucosa se puede probar un rango de dosificación más amplio, ya que la reactogenicidad sistémica parece ser menos preocupante. La administración mucosa con OMV contra la tos ferina también conduce a una mejor protección en comparación con la inmunización sistémica, como lo demostró previamente nuestro grupo25,26. Según la comparación de este estudio, también podemos concluir que, para la administración de vacunas por vía mucosa, lamentablemente el MAT no puede reemplazar al RPT ya que no puede imitar la administración local. Y aunque la reactogenicidad sistémica parece ausente en el RPT después de la inmunización intranasal con omvPV, se deben investigar más a fondo los problemas de seguridad locales utilizando otras pruebas in vivo o in vitro. Combinados, los hallazgos actuales favorecen el enfoque prometedor de la inmunización de las mucosas con OMV contra la tos ferina; sin embargo, también se puede aplicar la inmunización sistémica con OMV en dosis más bajas o con una modificación de LPS como una vacuna mejorada contra la tos ferina.

En general, podemos concluir de este estudio que el MAT ajustado se puede aplicar en múltiples etapas de la cadena de desarrollo de la vacuna, por ejemplo, detección de vacunas experimentales, monitoreo de la reactogenicidad de la vacuna antes de los ensayos clínicos (etapas preclínicas) y para la liberación de lotes durante el proceso. etapa clínica, para determinar la reactogenicidad de las vacunas que contienen pirógenos, como las vacunas OMV. El MAT se puede aplicar fácil y rápidamente para proporcionar los primeros indicios de reactogenicidad en las etapas preliminares del desarrollo de la vacuna cuando el RPT requiere demasiada mano de obra y es costoso. Además, con este ensayo se pueden detectar rápidamente modificaciones de la vacuna para reducir la reactogenicidad. Para los productos finales, el MAT puede servir como un ensayo valioso junto al RPT o, eventualmente, como reemplazo del mismo para evaluar la reactogenicidad de las vacunas que contienen pirógenos. Finalmente, con el MAT, combinado con los resultados del RPT, demostramos que nuestra vacuna contra la tos ferina basada en vesículas de membrana externa tiene un perfil de reactogenicidad seguro, que es necesario para una vacuna contra la tos ferina mejorada.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Correspondencia a Marijke WA Molenaar-de Backer o Bernard Metz.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Molenaar-de Backer, MWA, Doodeman, P., Rezai, F. et al. Alternativa in vitro para la evaluación de la reactogenicidad de vacunas basadas en vesículas de membrana externa. Informe científico 13, 12675 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39908-7

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Recibido: 14 de febrero de 2023

Aceptado: 02 de agosto de 2023

Publicado: 04 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39908-7

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