La divergencia funcional de CYP76AK da forma a la quimiodiversidad de abietane

Mar 28, 2024

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 4696 (2023) Citar este artículo

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El género Salvia L. (Lamiaceae) comprende innumerables hierbas medicinales distintas, con los terpenoides como uno de sus principales grupos químicos activos. Los diterpenoides de tipo abietano (ATD), como las tanshinonas y los ácidos carnósicos, son específicos de Salvia y exhiben diversidad química taxonómica entre linajes. Para dilucidar cómo evolucionó la diversidad química de ATD, llevamos a cabo análisis metabólicos y filogenéticos a gran escala de 71 especies de Salvia, combinados con la función enzimática, la secuencia ancestral y la reconstrucción de rasgos químicos, y experimentos de genómica comparativa. Este enfoque integrado demostró que las diversidades de ATD en todo el linaje en Salvia fueron inducidas por diferencias en la oxidación del esqueleto terpenoide en C-20, que fue causada por la divergencia funcional de la subfamilia CYP76AK del citocromo P450. Estos hallazgos presentan un patrón único de diversidad química en las plantas que fue moldeado por la pérdida de actividad enzimática y las vías catalíticas asociadas.

Los productos naturales de origen vegetal son un recurso valioso para la investigación farmacológica y el desarrollo de productos relacionados con la salud, y su diversidad estructural está relacionada con diversas actividades biológicas1. Tanto el Taxol, un alcaloide diterpenoide obtenido de Taxus chinensis (Pilg.) Rehder, como la Artemisinina, un sesquiterpenoide derivado de Artemisia annua L., han recibido mucha atención en todo el mundo debido a sus excepcionales efectos anticancerígenos y antipalúdicos, respectivamente2,3. Debido a la gran demanda de productos naturales, los enfoques para obtener compuestos específicos mediante ingeniería metabólica se han convertido en una tendencia importante, lo que requiere el esclarecimiento de las vías biosintéticas y la identificación de genes clave involucrados en estas vías.

La mayoría de los productos naturales obtenidos de las plantas son metabolitos especializados. Sin embargo, dilucidar una vía biosintética es limitada cuando la vía es compleja e incluye múltiples pasos, lo que dificulta la identificación de los genes relevantes4. Generalmente, la aparición de metabolitos especializados en las plantas es un mecanismo de defensa evolucionado que protege a las plantas contra una avalancha de estreses bióticos y abióticos, con diversidad química reflejada en la diversidad de sus esqueletos y modificaciones químicas5. En general, esqueletos similares se derivan de vías biosintéticas similares dentro de plantas homólogas. Sin embargo, los productos naturales basados ​​en los mismos esqueletos con diversas modificaciones químicas (p. ej., glicosilación, metilación, hidroxilación, acilación, prenilación) son diversos dentro de las especies. Estas modificaciones estructurales desempeñan un papel importante en la forma en que las plantas responden a los cambios en el entorno externo para su crecimiento y desarrollo6.

Dados los rápidos avances en las tecnologías ómicas recientes, ahora es posible rastrear el origen evolutivo, la distribución y la composición de los metabolitos a escala de linaje7, y arrojar luz sobre sus funciones antiguas o novedosas, así como la aparición y radiación de sus vías biosintéticas a lo largo del tiempo. time8 Por ejemplo, el Proyecto Genoma de la Planta de Menta ha hecho contribuciones significativas en este sentido, investigando los patrones de distribución de terpenoides volátiles en la familia Lamiaceae9 y explorando las radiaciones de la vía iridoide en varios linajes10. También han aportado información sobre los mecanismos detrás de la pérdida y posterior reevolución de la biosíntesis de nepetalactona en el linaje Nepeta11. Otro caso muy representativo es el origen del morfinano en el género Papaver (Papaveraceae). Al rastrear los eventos de fusión del gen STORR entre los genomas de Papaver y las duplicaciones correlacionadas del genoma completo (WGD), los reordenamientos cromosómicos y la evolución del subgenoma12,13,14, se demostró la innovación de este metabolito especializado. Por lo tanto, establecer el mecanismo genético para la formación de diversidad de productos naturales entre especies es de gran importancia para comprender las vías, proporcionando elementos sintéticos para la ingeniería metabólica y el mejoramiento molecular.

Las tanshinonas y los compuestos relacionados con el ácido carnósico son diterpenoides de tipo abietano (ATD) especializados en Lamiaceae15,16. Las tanshinonas se identificaron originalmente a partir de Salvia miltiorrhiza Bunge y se han utilizado para el tratamiento de la enfermedad de las arterias coronarias17, la angina de pecho18 y el infarto de miocardio19. El ácido carnósico y sus derivados que se encuentran en Salvia officinalis L. tienen fuertes actividades antioxidante16, antiparasitaria20, antitumoral21, antifúngica22, antiadipogénica23 y antibacteriana24. La biosíntesis específica de estos ATD se inicia a partir de la biosíntesis de su precursor común, el miltiradieno, catalizada por la copalil difosfato sintasa (CPS) y la kaureno sintasa (KSL)25. En S. miltiorrhiza, CYP76AH1 cataliza la oxidación del miltiradieno en el C-12 para formar ferruginol26. Además, otros miembros de la subfamilia CYP76AH pueden catalizar la oxidación del miltiradieno en C-7, −11 y −12 para generar una matriz de metabolitos con diversas modificaciones en los anillos ATD27,28,29,30. La subfamilia CYP76AK promueve aún más la especificidad y diversidad de los ATD en Salvia. CYP76AK6 de S. officinalis, Salvia fruticosa Mill. y Salvia pomifera L., CYP76AK7 y CYP76AK8 de Salvia rosmarinus Schleid convierten el 11-hidroxiferruginol en ácido carnósico generando un grupo carboxilo en C-2028,29,30, mientras que CYP76AK1 de S. miltiorrhiza solo ejecuta la hidroxilación en C-20 para generar un grupo alcohólico27. Esto sugiere que la diversidad funcional de CYP76AK puede contribuir a la presencia de diferentes tipos de ATD en varias especies de Salvia. Además, cabe señalar que el patrón de oxidación presente en la posición C-20 también podría desempeñar un papel crucial en la formación de miltirona, el precursor clave de las tanshinonas. Esto puede implicar el proceso de desmetilación (que resulta en la pérdida de C-20) y la aromatización del anillo B, que siguen siendo pasos catalíticos sin resolver en la ruta (Figura 1 complementaria). Por lo tanto, sería necesaria una caracterización de todo el linaje de la distribución de ATD, las funciones de CYP76AK y los eventos evolutivos relevantes para revelar la vía de biosíntesis de tanshinona. Además, en el caso de la evolución de la familia CYP en plantas, la dinámica de las CYP76AK proporcionaría información sobre la interacción entre la divergencia de funciones y la evolución del genoma en la evolución del clan CYP76AK31,32.

Salvia L. (Lamiaceae, Nepetoideae)33 es el género más grande de la familia de la menta que comprende ca. 1000 especies34, e incluye varias especies de importancia cultural y económica que se utilizan como hierbas tradicionales (p. ej., S. miltiorrhiza y S. officinalis)35, fragancias (p. ej., Salvia sclarea L.)36, plantas ornamentales (p. ej., Salvia splendens Sellow ex Wied-Neuw.)37 y alimentos funcionales (p. ej., Salvia hispanica L.)38. Salvia tiene una distribución cosmopolita que consta de tres centros de diversidad de especies: América Central y del Sur (ca. 500 especies), suroeste de Asia-Mediterráneo (ca. 250 especies) y Asia Oriental (ca. 100 especies)34. Salvia es conocida por tener una rica variedad de ATD, lo que la convierte en un género modelo adecuado para investigar los orígenes evolutivos de la diversidad de ATD39. Las tanshinonas se acumulan principalmente en S. miltiorrhiza40, Salvia przewalskii Maxim.41 y Salvia yunnanensis CHWright42, mientras que se han encontrado metabolitos relacionados con el ácido carnósico en especies de salvia europea como S. officinalis43, S. fruticosa44 y S. pomifera45. Sin embargo, no está claro si las diferencias metabólicas representan un evento aislado o una variación constante causada por la diferenciación de clados dentro del género. Por lo tanto, el patrón correlacionado general entre la diversidad química y la diversidad genética basado en una filogenia sólida del género es la base para investigar la formación de ATD en este género económicamente importante.

Aquí, combinamos los conceptos de reconstrucción filogenética, análisis de metabolomas, análisis de vías y mecanismos evolutivos para caracterizar 71 especies de Salvia e investigar los mecanismos moleculares y evolutivos que dieron como resultado la diversidad de ATD en el género. Nuestro análisis del metaboloma reveló la distribución de los ATD en este género, y luego se realizaron ensayos de actividad enzimática in vitro para investigar los mecanismos por los cuales la subfamilia CYP76AK está involucrada en la biosíntesis de los ATD. Además, se propuso un modelo evolutivo de la subfamilia CYP76AK basado en genómica comparada, análisis filogenéticos y enzimología de enzimas biosintéticas ancestrales reconstruidas. Nuestros resultados sugieren que la evolución de la familia CYP76AK puede haber jugado un papel importante en la diversidad química de los ATD en Salvia.

Para caracterizar la diversidad química y las relaciones filogenéticas dentro del género Salvia, se seleccionaron 77 especies, incluidos seis grupos externos (Melissa officinalis L., Mentha spicata L., Clinopodium polycephalum (Vaniot) CYWu & SJHsuan, Origanum vulgare L., Nepeta cataria L. y Prunella. vulgaris L.), se tomaron muestras para análisis (Datos complementarios 1), que cubren las principales áreas de distribución geográfica (América, Asia occidental, Europa y Asia oriental) del género, excepto África. En total, generamos 72 nuevos transcriptomas, a partir de bibliotecas mixtas de ADNc de hojas y raíces, lo que resultó en un promedio de 40.876 transcripciones que representan 38,2 Mb por especie (Datos complementarios 1). Además de tres transcriptomas publicados (M. officinalis, M. spicata y O. vulgare)9 y dos genomas (S. miltiorrhiza y N. cataria)11,46, se obtuvieron 77 conjuntos de genes nucleares para nuestros análisis. Se aplicaron cinco conjuntos de grupos ortólogos (OG), compuestos por 2178, 1532, 1169, 512 y 130 genes ortólogos, respectivamente, para reconstruir la filogenia de Salvia utilizando un método coalescente a través de un procedimiento de varios pasos teniendo en cuenta la longitud de alineación y la cobertura de especies. y otros factores (Fig. 1; Figs. complementarias 2 a 6). La monofilia del género Salvia y seis subgéneros (Calosphace, Audibertia, Glutinaria, Sclarea, “Heterosphace” y Salvia) fueron respaldadas al máximo (soporte de arranque [BS] = 100%; Fig. 1; Figs. complementarias 2-6). De acuerdo con estudios de filogenia previos47,48, el género se dividió en tres clados principales sucesivos (Clado I, II y IV) que reflejaban su distribución geográfica, que podría dividirse aproximadamente en Eurasia, América y Asia Oriental. Salvia abrotanoides (Kar.) Sytsma y S. rosmarinus, pertenecientes a los subgéneros Perovskia y Rosmarinus (PR), son hermanas del Clado I. Por lo tanto, la filogenia de Salvia proporcionó una agrupación bien respaldada para un mayor perfil metabólico de todo el linaje.

Cinco niveles de valores de arranque se indican con círculos sólidos rojo, azul, amarillo, negro y verde. Los círculos verdes sólidos indican topologías alternativas para el nodo entre los cinco árboles (consulte las figuras complementarias 2 a 6). Las especies que pertenecen al mismo subgénero están marcadas con el mismo color de rama. Los nombres de las especies se muestran a la derecha del árbol y los clados se indican en el extremo derecho y se resaltan con etiquetas de colores. Las estrellas sólidas de colores indican la duplicación del genoma identificada en este estudio. Hace millones de años, P Plioceno, Q Cuaternario, duplicación del genoma completo WGD, triplicación del genoma completo WGT. PR subgéneros Perovskia y Rosmarinus. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Según el árbol construido a partir de 130 concatenaciones de OG para todos los taxones con cuatro fósiles como puntos de calibración, se estimó aún más la escala de tiempo evolutiva de los linajes de Salvia (Fig. 1, Fig. 7 complementaria). Nuestro cronograma ilustró que el origen del género Salvia podría fecharse entre el Eoceno tardío (hace ~38,1 millones de años, Mya) y el Oligoceno medio (~26,1 Mya), ya que se estimó que el grupo de la corona de Salvia ocurrió en ~32,1 Mya con un intervalo de credibilidad (IC) del 95% de 26,1 a 38,1. Poco después de eso, el grupo de la corona del Clado I, Rosmarinus y Perovskia podría haber aparecido hace ~29,5 millones de años (IC del 95%: 23,7–35,2). Paralelamente, el nódulo que contiene tanto el Clado II como el Clado IV podría originarse hace aproximadamente 28,2 millones de años (IC del 95 %: 22,7–33,8). Posteriormente, se estimó que el Clado II y el Clado IV divergían en ~22,1 millones de años (IC del 95%: 17,6–27,0) y ~9,1 millones de años (IC del 95%: 6,7–11,8), respectivamente.

Con base en los transcriptomas y los conjuntos de datos del genoma disponibles, también identificamos eventos de duplicación del genoma completo (WGD) entre especies de Salvia de acuerdo con sustituciones sinónimas por sitio (KS) entre pares de genes parálogos (Fig. 1; Fig. 8 complementaria). En primer lugar, en nuestra escala de muestreo se confirmaron dos eventos WGD previamente conocidos, el evento gamma compartido por las eudicotiledóneas centrales (KS = 2,27 en promedio) y el evento WGD compartido por Lamiaceae (KS = 1,18 en promedio) 37,49. No encontramos un evento de WGD común entre todo el género Salvia; sin embargo, identificamos un WGD de linaje compartido (KS = 0,30 en promedio) en el Clado II. Además, algunas especies individuales parecían haber experimentado eventos WGD únicos, es decir, S. splendens, Salvia lyrata L. y Salvia roemeriana Scheele.

Comprender la relevancia entre la diversidad química y la información genética es esencial para dilucidar las vías biosintéticas y extraer genes funcionales. Las raíces y hojas de 71 especies de Salvia se prepararon y analizaron mediante un enfoque metabolómico basado en cromatografía líquida y espectrometría de masas (LC-MS). Los cromatogramas de corriente iónica total (TIC) revelaron que los ácidos fenólicos y los ATD eran los principales metabolitos tanto en las raíces como en las hojas de Salvia (Figuras complementarias 9 a 24). Después de la detección, alineación y normalización de picos utilizando las herramientas MS-DIAL, las tablas de características resultantes se dividieron en dos tablas según el nivel de acumulación de ácidos fenólicos y ATD y se importaron a SIMCA-P para la investigación de qué clasificación de metabolitos está estrechamente asociada con la evolución de la Salvia (Datos complementarios 2 a 7). La acumulación de ATD en raíces y hojas condujo a una división discernible entre los cuatro clados utilizando el análisis de componentes principales (PCA) en comparación con los ácidos fenólicos, particularmente los resultados de agrupamiento en el modo de iones positivos (Figuras complementarias 25 y 26), lo que fue consistente con la Resultados del análisis filogenético (Fig. 1).

En la Fig. 2a, se identificaron las 36 ATD más prevalentes tanto en raíces como en hojas de las 71 especies de Salvia y se clasificaron en cinco grupos (A-E) según las características estructurales. Se utilizaron estándares de referencia y pérdidas neutras de diagnóstico para identificar las modificaciones químicas de los anillos y grupos metilo en C-20 (Datos complementarios 8 y figuras 27 a 31). La Figura 2b muestra los patrones de acumulación de los 36 ATD en las 71 especies de Salvia, así como las relaciones entre las modificaciones químicas y la especificidad de los órganos. La hidroxilación y la carbonilación en los anillos fueron reacciones comunes en las vías biosintéticas de ATD que ocurren en los cuatro clados de Salvia. La acumulación de ATD 20-ceto y 20-carboxilo mostró especificidad de especie en los Clados I, II y PR. Además, la fuerte especificidad orgánica encontrada en los derivados carboxilados y epóxidos, como el ácido carnósico y el carnosol, se detectó sólo en hojas de especies individuales de los Clados I, II y PR. A diferencia de otros ATD con 20 átomos de carbono, las tanshinonas (grupo B) tuvieron una mayor respuesta iónica en el modo de iones positivos y se acumularon específicamente en las raíces. Por lo tanto, aunque la diversidad química de ATD se derivó de diversas modificaciones químicas de anillos y grupos metilo, el patrón de acumulación y la especificidad del órgano se correlacionaron con modificaciones específicas del grupo metilo. La miltirona (Compuesto 6 en la Fig. 2), el precursor clave de la síntesis de tanshinona, estaba presente en todos los clados y se forma mediante reacciones poco claras de desmetilación acoplada de C-20 y aromatización del anillo B basado en 11-hidroxiferruginol15. Sin embargo, las tanshinonas más diversas formadas por heterociclación, desmetilación y aromatización posteriores están presentes solo en el Clado IV15. Por lo tanto, C-20 es una posición potencialmente crítica: cuando los anillos y grupos metilo en C-20 se modifican mediante sustituciones variadas, se correlaciona con la formación de diversas estructuras características de ATD y promueve la especificidad de especies y órganos en Salvia.

a Treinta y seis ATD se dividieron en cinco grupos según diferentes características estructurales. Los ATD en los grupos A, C, D y E (que se acumularon específicamente en las hojas) exhibieron intensidades más altas en el modo de iones negativos, y los ATD en el grupo B (que se acumularon específicamente en las raíces) exhibieron intensidades más altas en el modo de iones positivos. 1:7,20-Dihidroxiabietaquinona; 2: 16, 20-Dihidroxiabietaquinona; 3: 7-ceto, 20-hidroxiabietaquinona; 4: 11, 20-Dihidroxisugiol; 5: 20-Hidroxiabietaquinona; 6: Miltirona; 7: criptotanshinona; 8: Tanshinona IIA; 9:1,2-Dihidrotanshinquinona; 10: Dihidrotanshinona I; 11: Metiletanshinquinona; 12: Tanshinona I; 13: Przewaquinona C; 14: 7-ceto-royleanona; 15: Royleanona; 16: 11-Hidroxisugiol; 17: 7-hidroxiroileanona; 18: 6-hidroxiroileanona; 19: 6-ceto-11-hidroxisugiol; 20: 7, 11-Dihidroxiferruginol; 21: 11, 14-Dihidroxisugiol; 22: 11-Hidroxiferruginol; 23: 20-ceto-2,11-dihidroxiferruginol; 24: 20-ceto-11-hidroxisugiol; 25: 20-ceto-7-hidroxiferruginol; 26: 20-ceto-6-hidroxiferruginol; 27: 20-ceto-7-acetilferruginol; 28: 7-hidroxi-20-carboxyabietaquinona; 29: 7-Hidroxiisocarnosol; 30: 6-Hidroxicarnosol; 31: ácido 7-cetocarnósico; 32: 7-Metoxicarnosol; 33: 6-Metoxicarnosol; 34: carnosol; 35: ácido carnósico; 36: Carnosato de metilo. b Patrones de distribución de las 36 ATD en 71 especies de Salvia. PR, subgéneros Perovskia y Rosmarinus. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Dado que el patrón de oxidación del C-20 podría provocar la divergencia de los ATD entre los linajes de Salvia. Por lo tanto, CYP76AK, una subfamilia CYP específica de Lamiaceae que previamente se descubrió que cataliza la oxidación del C-2027,28,29,30,32, podría haber dado forma a dicha diversidad metabólica. Para examinar la actividad enzimática en las CYP76AK, se anotaron todos los genes CYP76AK de los 71 transcriptomas que generamos para estudiar primero su relación filogenética. Se obtuvieron un total de 185 supuestas secuencias de longitud completa y se utilizaron para generar un árbol de máxima verosimilitud (ML) (Fig. 3), que clasificó la subfamilia CYP76AK en nueve clados bien resueltos (a saber, CYP76AK1, 2, 3, 5, 6). , 7, 8, 18 y 22; Datos complementarios 9 y Fig. 32) con una distribución taxonómica amplia. Los CYP76AK6 eran exclusivos del Clado I, así como el único clado CYP76AK en este linaje. CYP76AK7, 22, 18 eran específicos del linaje Clado II. Mientras tanto, CYP76AK1, 2 y 3 eran básicamente específicos del linaje Clado IV. Además, los genes CYP76AK3, 7, 8 y 22 también se anotaron a partir de los transcriptomas de PR.

El color de la rama representa el linaje al que pertenecen las especies que contienen estos genes CYP76AK. Consulte la Fig. 32 complementaria para ver el filograma anotado. PR, subgéneros Perovskia y Rosmarinus. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Hasta ahora, sólo se han caracterizado funcionalmente unos pocos miembros de CYP76AK27,28,29,30. Para investigar si cada clado exhibe propiedades catalíticas divergentes, se seleccionaron un total de dieciséis CYP76AK, que cubren todos los clados, para la investigación funcional in vitro utilizando un sistema de expresión de microsomas de levadura. Se probaron dos sustratos, 11-hidroxiferruginol y 11-hidroxisugiol para dilucidar los patrones de oxidación en C-20. Debido a que el 11-hidroxiferruginol no estaba disponible comercialmente, se introdujo SmCYP76AH3 en la cepa de levadura WAT11 para transferir ferruginol al 11-hidroxiferruginol como fuente de sustrato (Fig. 4a). Los productos de oxidación secuencial se analizaron utilizando LC-MS de acuerdo con sus características de MS (Figura complementaria 33). Cuando se usó 11-hidroxiferruginol como sustrato, se produjeron dos productos (11, 20-dihidroxiferruginol y ácido carnósico), que representan los productos para la hidroxilación y la carboxilación en C-20. Entre las CYP76AK que probamos, no se observaron productos para SmCYP76AK3 y 5. SmCYP76AK2, SpCYP76AK22 y ScCYP76AK18 exhibieron actividad de hidroxilación, y solo ScCYP76AK18 tuvo actividad de carboxilación posterior. En conjunto con las descripciones funcionales anteriores de CYP76AK1, 6, 7 y 827,28,29,30, suponemos que las CYP76AK exhiben tres propiedades catalíticas distintas hacia el 11-hidroxiferruginol, es decir, CYP76AK1, 2 y 22 solo pueden exhibir hidroxilación de C-20, mientras que CYP76AK6, 7, 8 y 18 tenían propiedades de oxidación adicionales para producir ácido carnósico. Además del 11-hidroxiferruginol, SmCYP76AK1 pudo convertir 11-hidroxisugiol en 11, 20-dihidroxisugiol27. Para probar si otros clados de CYP76AK también tienen promiscuidades, se introdujo 11-hidroxisugiol en las preparaciones de microsomas que expresan cada CYP76AK seleccionado (Fig. 4b). Como resultado, todos los CYP76AK, excepto CYP76AK3 y 5, fueron capaces de catalizar la oxidación C-20 del 11-hidroxisugiol. A diferencia del uso de 11-hidroxiferruginol como sustrato, se detectaron productos 20-ceto en los productos de CYP76AK6, 7, 8 y 18. Además, los productos carboxilados (ácido 7-ceto-carnósico se purificaron e identificaron mediante resonancia magnética nuclear (RMN). ), Fig. complementaria 34) se obtuvieron a su vez. De manera consistente con los grupos de alimentación de 11-hidroxiferruginol, CYP76AK1, 2 y 22 solo exhibieron oxidación en un solo paso para producir 11, 20-dihidroxisugiol. Además, también seleccionamos CYP76AK complementarias de cada clado para confirmar la función (Figura complementaria 35), lo que demuestra que las CYP76AK del mismo clado tenían funciones consistentes.

a Análisis de cromatograma de iones extraídos (EIC) de los productos de reacción catalítica de CYP76AK in vitro con 11-hidroxiferruginol. Para obtener 11-hidroxiferruginol, todos los plásmidos contenían SmCYP76AH3, que convierte el ferruginol en 11-hidroxiferruginol. Una muestra con solo proteína SmCYP76AH3 funcionó como control negativo. Los picos correspondientes a productos potenciales se indican mediante el valor m/z de 11, 20-dihidroxiferruginol (m/z 317,2115) y ácido carnósico (m/z 331,1900). b Superposiciones de EIC que muestran actividad catalítica in vitro de CYP76AK con 11-hidroxisugiol. La muestra con el vector vacío (pESC-His) funcionó como control negativo. Los picos correspondientes a productos potenciales se indican mediante el valor m/z de 11, 20-dihidroxisugiol (m/z 331,1900), 20-ceto-11-hidroxisugiol (m/z 329,1745) y ácido 7-cetocarnósico (m/ 345.1695). c Resumen de la actividad enzimática de CYP76AK.

En conjunto, los CYP76AK parecen realizar tres tipos de propiedades catalíticas, al tiempo que mantienen una divergencia filogenética distinta (Fig. 4c): i: CYP76AK7, 6, 18 y 8 pudieron realizar una oxidación catalítica sucesiva en C-20; ii: CYP76AK1, 2 y 22 solo exhibieron el paso de hidroxilación; iii: CYP76AK3 y 5 no mostraron capacidad catalítica ni para el 11-hidroxiferruginol ni para el 11-hidroxisugiol. Para tener en cuenta más a fondo las propiedades catalíticas, la relación filogenética de la subfamilia CYP76AK y la distribución de ATD, parece haber una fuerte correlación entre la divergencia funcional de CYP76AK y la acumulación específica de especie de ATD entre diferentes linajes de Salvia. Por ejemplo, los productos 20-ceto como 20-ceto-11-hidroxisugiol fueron generados específicamente por CYP76AK6, 7, 8 y 18. En consecuencia, dichos ATD 20-ceto se restringieron al Clado I, II, además del PR (Fig. . 2), que eran consistentes con la distribución de los clados CYP76AK, es decir, CYP76AK6 podría contribuir al Clado I, CYP76AK7 y 8 en el Clado II del género.

Los patrones transcripcionales de restricción de órganos de los genes CYP76AK proporcionaron evidencia adicional de sus contribuciones a la diversidad de los ATD. Utilizando la secuenciación de ARN, probamos patrones de transcripción de genes CYP76AK en hojas y raíces de diecisiete especies seleccionadas de Salvia (Fig. 5), revelando su distribución según linajes y diversos patrones de expresión específicos de órganos. Generalmente, los genes CYP76AK que pertenecen al mismo clado tenían un patrón de transcripción idéntico y presentaban una distribución orgánica idéntica a los metabolitos correspondientes en el linaje. Por ejemplo, en el Clado IV y el Clado II, respectivamente, CYP76AK1 y 22 catalizaron exclusivamente la hidroxilación de C-20 con expresión específica de la raíz, lo que demuestra su papel distintivo en la producción de tanshinonas. Por el contrario, los productos 20-carboxílicos, como el ácido carnósico, se acumularon específicamente en las hojas de los linajes basales del Clado I y del Clado II, respectivamente, lo que probablemente se debió a la expresión específica de órgano de CYP76AK6, 7, 8 y 18. en hojas de las correspondientes especies de Salvia. Cabe señalar que aunque CYP76AK3 y 5 no demostraron actividad hacia los sustratos probados en nuestro estudio, se encontraron niveles sustanciales de transcripción en las raíces de las especies relevantes de Salvia, lo que indica sus funciones catalíticas no reveladas hacia otros sustratos no identificados.

Mapa de calor de expresión genética para miembros de la subfamilia CYP76AK de especies representativas de cada rama de Salvia, que muestra los niveles de expresión relativos en hojas (L) y raíces (R). El mapa de calor muestra tres réplicas biológicas, cada una trazada individualmente. Los valores de expresión representan valores de registro transformados por puntuación Z (TPM + 1). Las abreviaturas de las especies se pueden encontrar en los Datos complementarios 1. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Los estudios funcionales filogenéticos, metabólicos y catalíticos anteriores revelaron que esta divergencia metabólica distinta estuvo acompañada por la evolución de la subfamilia CYP76AK en cada linaje de Salvia. Para rastrear la ruta evolutiva de la vía de los ATD en Salvia, se realizaron análisis comparativos del genoma y reconstrucción de genes ancestrales y rasgos metabólicos. Actualmente, hay seis genomas de Salvia disponibles, lo que nos permite investigar la historia evolutiva de los genes CYP76AK en la mayoría de los linajes de Salvia. Estos son S. rosmarinus50 (PR), S. officinalis30 (Clado I), S. miltiorrhiza46 y Salvia bowleyana Dunn51 (Clado IV), S. hispanica52 (linaje norteamericano del Clado II) y S. splendens37 (linaje sudamericano del Clado II). Clado II). Primero, se investigaron los bloques de microsíntenios para determinar la historia evolutiva de las CYP76AK (Fig. 6a). Se observaron regiones sinténicas conservadas que contienen CYP76AK en todos los genomas estudiados y no se ubicaron en el grupo de genes conocido relacionado con la biosíntesis de diterpenoides30,53. Había dos regiones duplicadas en el genoma de N. cataria, lo que permitió rastrear el ancestro de los genes CYP76AK antes de la especiación de Salvia. Mientras tanto, se descubrió una duplicación de la región que mostraba una correlación obvia con el evento WGD de cada genoma. Para N. cataria y S. rosmarinus, la duplicación probablemente se debió a sus eventos únicos de WGD. En el genoma de S. hispanica, la duplicación estaba relacionada con el WGD común del Clado II. Posteriormente, S. splendens experimentó otro evento WGD único, que finalmente resultó en un genoma con cuatro regiones duplicadas. Por lo tanto, el descubrimiento de las regiones sinténicas y sus eventos de duplicación sugirió que esta región contenía CYP76AK ancestrales en el genoma del ancestro de Salvia. Junto con la evolución del genoma, CYP76AK se originó y evolucionó en clados divergentes en diferentes linajes de Salvia. En la filogenia de CYP76AK (Fig. 3) y Salvia, CYP76AK7 y 22 podrían haber surgido primero en el ancestro de los linajes de Salvia como se muestra en el genoma de S. rosmarinus, y los eventos de duplicación posteriores condujeron a CYP76AK8 (S. rosmarinus). y CYP76AK18 (clado II). En taxones que no han sufrido eventos de WGD, CYP76AK se separa en CYP76AK1 (clado IV) y CYP76AK6 (clado I). Además, no se descubrió ninguna relación de colinealidad para CYP76AK2, 3 y 5 entre todos los genomas de Salvia (Datos complementarios 10). Su aparición podría haber sido causada por eventos de duplicación únicos en ciertas especies o linajes (por ejemplo, duplicación segmentaria y mediada por transposones)54.

a Las relaciones sinténicas entre los genes CYP76AK en los genomas de Salvia revelaron la divergencia de los clados CYP76AK. El árbol filogenético en el panel izquierdo representa la filogenia de seis especies de Salvia con N. cataria como grupo externo. Los eventos de WGD se indican con puntos rojos. Microsintonia de genes CYP76AK en los bloques de sintenía. Los polígonos rojos muestran relaciones sinténicas entre los genes CYP76AK y los polígonos grises muestran otros genes. Anc-CYP76AK, gen ancestral CYP76AK. b Reconstrucción de proteínas ancestrales CYP76AK. Los nodos ancestrales (ancNodes) 1-6 muestran la enzima resucitada de cada punto de ramificación principal del árbol filogenético CYP76AK. Los caracteres funcionales de cada rama se distinguen por diferentes colores. c, d Función ancestral de CYP76AK. Cromatogramas iónicos extraídos (EIC) que muestran la actividad catalítica in vitro de cada CYP76AK ancestral utilizando 11-hidroxiferruginol y 11-hidroxisugiol como sustrato, respectivamente. e Evolución de la biosíntesis de ATD en Salvia. El árbol filogenético muestra la especiación de los clados de Salvia, y los diamantes representan los rasgos metabólicos ancestrales predichos para cada nodo de especiación. Los marcos cuadrados representan los rasgos metabólicos realistas de cada clado de Salvia, como se muestra en la Fig. 3. El verde, el rojo y el azul claro representan la existencia de ácido carnósico, tanshinonas y 20-ceto ATD, respectivamente. La escala de tiempo de la izquierda refleja el tiempo de especiación de cada clado. Las ramas resaltadas en azul claro indican clados en los que se han conservado los rasgos metabólicos ancestrales. f Cronología de los genes CYP76AK. El árbol filogenético representa la evolución de los clados CYP76AK según el modelo MCMCtree. Se etiqueta el tiempo de especiación de cada clado. Las ramas resaltadas en azul indican clados CYP76AK que han conservado sus funciones catalíticas ancestrales, y las ramas resaltadas en rojo indican clados que han sufrido una pérdida de función. Las flechas en la parte inferior indican el clado CYP76AK que contribuye a producir el tipo de ATD en el linaje correspondiente. Las flechas verde, roja y gris índigo indican la biosíntesis de ácido carnósico, tanshinonas y 20-ceto ATD, respectivamente. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Teniendo en cuenta las diferencias funcionales entre las CYP76AK en el contexto de sus historias evolutivas, la divergencia de la actividad catalítica en C-20 parecía representar una pérdida taxonómica de función más que una neofuncionalización. Así, se realizó la reconstrucción de genes ancestrales y la validación de funciones. Según la filogenia de CYP76AK, se seleccionaron seis nodos de rama para la resurrección de enzimas ancestrales (Fig. 6b, Datos complementarios 11). La enzima ancestral correspondiente a cada uno de estos nodos se expresó en levadura y se confirmó funcionalmente utilizando 11-hidroxiferruginol y 11-hidroxisugiol como sustratos. De acuerdo con las expectativas, todos los ancestros de CYP76AK exhibieron hidroxilación, carbonilación y carboxilación en C-20 tanto de 11-hidroxiferruginol como de 11-hidroxisugiol, ya que cada producto de oxidación fue producido por cada ancestro de CYP76AK (Fig. 6c, d). El nodo 6 representaba la proteína CYP76AK más ancestral, que exhibía una función de oxidación completa, lo que indica que dicho rasgo catalítico de las CYP76AK ya se había adquirido cuando la subfamilia CYP76AK surgió inicialmente en Salvia. El nodo 3 (ancestro de CYP76AK1, 2, 5, 8, 18 y 22) y el nodo 2 (ancestro de CYP76AK1, 2, 5, 8 y 18) también exhibieron capacidades de oxidación completa hacia C-20, lo que implica que CYP76AK1, 2 , y 22 (que solo realizan hidroxilación) pierden la actividad de carboxilación. CYP76AK3 y 5 no mostraron actividad catalítica con ninguno de los sustratos evaluados (Fig. 4), lo que sugiere que los CYP en los dos clados experimentaron una pérdida completa de actividad hacia los sustratos probados. Podrían sufrir pseudogenización o tener actividades catalíticas hacia otros sustratos desconocidos.

Teniendo en cuenta la historia evolutiva de las CYP76AK en la Salvia, la diversidad metabólica de los ATD parece representar una pérdida de vía más que una innovación metabólica. Por lo tanto, la reconstrucción del fenotipo ancestral (APR) se realizó de acuerdo con los rasgos químicos realistas en cada taxón para predecir los rasgos químicos de sus ancestros comunes (Figura complementaria 36). Las capacidades para producir ácido carnósico, tanshinona o ATD 20-ceto se consideraron rasgos clave. Se indicó que los APR para los primeros nodos de especiación de la filogenia de Salvia (PR y Clado I, II y IV) producían todos los tipos de ATD, lo que implica que el antepasado de Salvia probablemente produjo todos los ATD. Con la especiación de Salvia, este rasgo químico se retuvo en PR (S. rosmarinus) y los taxones norteamericanos en el linaje Clado II, pero se perdió parcialmente en otros linajes. Se observó pérdida de actividad a nivel de clado en la historia evolutiva de CYP76AK, lo que sugiere una causa importante de la diversidad metabólica entre linajes. Para modelar cómo la evolución de la actividad de las CYP76AK dirigió la diversidad de las ATD, se evaluó más a fondo la cronología de todas las CYP76AK (Figura complementaria 37). Se presentaron los clados CYP76AK que se originaron a partir de los segmentos sinténicos ancestrales (Fig. 6e, f). La cronología reveló que el MRCA de CYP76AK (~76,4 millones de años) estuvo presente en un momento mucho anterior a la primera divergencia entre CYP76AK7 y los otros clados (~45,1 millones de años). Cada clado surgió en el momento de la especiación de sus linajes correspondientes, o justo después de ella. Por ejemplo, CYP76AK6 podría haber surgido junto con la especiación del Clado I (~20,4 millones de años). Además, la pérdida de actividad de CYP76AK22 (~26,3 millones de años) y CYP76AK1 (~7,9 millones de años) se produjo después de la especiación de S. rosmarinus (~27,2 millones de años) y del Clado IV (~9,1 millones de años), respectivamente.

Según los rasgos catalíticos, la distribución del linaje y el patrón transcripcional de cada clado CYP76AK, se puede determinar el gen que contribuye a la biosíntesis de ATD en un linaje particular. CYP76AK7 se encontró en S. rosmarinus y Clade II, contribuyendo así a la biosíntesis del ácido carnósico en las partes aéreas del linaje correspondiente. Sin embargo, CYP76AK7 también podría ser responsable de la acumulación de ATD 20-ceto en raíces de especies de los taxones sudamericanos del Clado II. CYP76AK6 estuvo presente sólo en el Clado I; por lo tanto, podría permitir la biosíntesis de metabolitos relacionados con el ácido carnósico y ATD 20-ceto en órganos específicos. CYP76AK22 se retuvo en S. rosmarinus y Clade II y se expresa solo en raíces donde es responsable de la acumulación de tanshinona. Mientras tanto, CYP76AK1 contribuyó a la biosíntesis de tanshinona solo en el Clado IV. Además, CYP76AK8/18 compartía una distribución similar a CYP76AK22 y podría realizar hidroxilación y carbonilación en raíces para la biosíntesis de 20-ceto ATD. En general, los estudios previos sobre la evolución metabólica de los ATD y nuestros hallazgos sobre la divergencia funcional de la subfamilia CYP76AK respaldan un modelo de diversidad metabólica en los linajes de Salvia basado en la pérdida de actividad.

En este estudio, combinamos filogenia de todo el linaje, perfiles metabólicos, comparación genómica y análisis de evolución de la función enzimática para ilustrar cómo los ATD divergen en el género Salvia. Nuestro perfil metabólico para los ATD proporciona el modelo para la evolución de la vía de los ATD y sirve como un ejemplo de diversidad química en las plantas debido a la pérdida de actividades de las enzimas catalíticas.

Las reconstrucciones filogenéticas anteriores de Salvia se basaban principalmente en genes ribosómicos, mitocondriales y de cloroplastos, y algunos genes nucleares codificadores de proteínas se habían utilizado en la filogenia de Salvia a nivel familiar47,48,55,56,57,58,59. 60. La heredabilidad uniparental de los genes orgánulos, así como la recombinación y transformación de genes en el genoma del plástido, ha dado lugar a sesgos e imprecisiones en la reconstrucción filogenética61. Por el contrario, los genes nucleares tienen muchas ventajas, como su gran número y su herencia parental. El uso de conjuntos de genes nucleares evaluados minuciosamente puede proporcionar evidencia de linajes de angiospermas profundos sólidos y bien respaldados62,63,64,65. Aquí, presentamos un análisis filogenético de Salvia basado en genes nucleares a gran escala, obtenidos de la secuenciación del transcriptoma con la escala de muestreo más grande para el linaje de Salvia hasta la fecha, para inferir relaciones infragenéricas dentro del género. De acuerdo con estudios previos, S. abrotanoides y S. rosmarinus formaron un clado con especies de Salvia, mientras que M. officinalis actuó como un clado hermano47,48,55,56,59,60.

Morfológicamente, el género Salvia definido tradicionalmente se distingue de otros géneros de Lamiaceae en que dos de sus estambres fértiles están separados por un tejido conectivo significativamente alargado. Sin embargo, los estudios filogenéticos moleculares ampliaron la Salvia para incluir otros géneros (es decir, Dorystaechas, Meriandra, Perovskia, Rosmarinus y Zhumeria)47,48,55,56,57,58,59,60. Aquí, aunque los representantes de “Rosmarinus” y “Perovskia” formaron un grupo hermano del Clado I (Fig. 1), los rasgos metabólicos de los ATD y las propiedades catalíticas de las CYP76AK en dos subgéneros son claramente diferentes de los del Clado I. Por lo tanto, el Los hallazgos anteriores podrían proporcionar nuevos conocimientos sobre más aspectos de la atribución taxonómica de Dorystaechas, Meriandra y Zhumeria.

Los CYP oxidan el esqueleto de hidrocarburos generado por la terpenoide sintasa durante la biosíntesis de terpenoides de las plantas, mientras que también se producen modificaciones químicas que incluyen hidroxilación, oxidación continua, reordenamiento de anillos y heterociclación. Estas reacciones aumentan en gran medida la diversidad estructural de los terpenoides, al tiempo que proporcionan puntos de anclaje para futuras modificaciones de los grupos. Por lo tanto, los CYP se consideran factores clave para la diversidad de terpenoides vegetales32. Según nuestros análisis de metabolomas, los ATD con anillos modificados (grupo C) no mostraron una acumulación específica en todos los clados y fueron producidos por genes funcionales como la subfamilia CYP76AH, que es capaz de llevar a cabo la carbonilación en C-7 del anillo B27. A diferencia de las modificaciones realizadas por el CYP76AH, las modificaciones químicas en el C-20 son impulsadas por la diversa familia CYP76AK, que es responsable de la acumulación y la especificidad orgánica de los ATD en la Salvia. Según las Figs. 2 y 5, el gen CYP76AK1 estaba altamente expresado en raíces de taxones del Clado IV y produce ATD de 20-hidroxilo (grupo A), cuyos patrones de acumulación eran similares a los de la miltirona, especialmente para la 7,20-dihidroxiabietaquinona (compuesto 1), 7-ceto-20-hidroxiabietaquinona (compuesto 3) y 20-hidroxiabietaquinona (compuesto 5), de los que se especula que los ATD de 20-hidroxilo son los principales precursores de la síntesis de miltirona. Al ser similar a CYP76AK1, también se descubrió que CYP76AK22 produce derivados hidroxilados en C-20 para la síntesis de miltirona en especies individuales del Clado II y PR, y también tenía un alto nivel transcripcional en las raíces (Fig. 5). A diferencia del Clado I, las especies caen en el Clado II ya que S. pachyphylla, S. apiana y S. columbariae producen criptotanshinona. La producción de criptotanshinona (Compuesto 7; Fig. 2) por parte de la familia CYP71D que actúa sobre la miltirona para la heterociclación del anillo D mostró que las especies del Clado II tenían una vía biosintética de tanshinona más completa que las especies del Clado I (Fig. 2)53. Sin embargo, la mayoría de las tanshinonas posteriores fueron más abundantes en el Clado IV, lo que indica que la biosíntesis de ATD en el Clado IV consistió predominantemente en la síntesis de tanshinona (grupo B). Esta fue también la posible razón por la cual los ATD comunes con 20 átomos de carbono (grupo C) en los Clados I y II se acumularon a niveles más altos (Fig. 2). Además, la aromatización posterior del anillo A requiere genes funcionales para la hidroxilación en C-18 o −19, que se expresaron exclusivamente en el Clado IV. Además, se detectó un producto secundario de SmCYP76AK1 y ScCYP76AK22 cuando se usó 11-hidroxisugiol como sustrato (tiempo = 17,25 min; Fig. 4b), que se identificó tentativamente como 6-hidroxi-7-cetoabietaquinona (Fig. 38 complementaria). Esta función secundaria podría contribuir a los ATD con grupo hidroxilo en C-6 en el Clado II (Compuesto 18) y IV (Compuesto 18, 26 y 30). En consecuencia, aún es necesario explorar la respuesta de las enzimas para la oxidación de C-6 en el Clado I y PR.

Además de la importancia de CYP76AK1 y CYP76AK22 para la síntesis de ATD de 20-hidroxilo y tanshinonas, la acumulación única de ATD de 20-ceto (grupo D) en los Clados I, II y PR se basó en la expresión específica de CYP76AK6, 7, y 18/8. Mientras que CYP76AK6 se expresó únicamente en el Clado I, CYP76AK7 y 8/18 se expresaron en el Clado II y PR, y realizaron actividades similares de hidroxilación, carbonilación y carboxilación en C-20 en los ensayos de actividad enzimática in vitro (Fig. 4). En los ensayos de actividad enzimática, también se encontró que los derivados 20-carboxílicos, como el ácido carnósico (Compuesto 35), oxidan espontáneamente los ATD 20-epoxi como el carnosol (Compuesto 34) (Figura complementaria 39)28. Sin embargo, las especies con mayor expresión de CYP76AK6, 7 u 8/18 en hojas, como S. officinalis en el Clado I, S. columbariae en el Clado II y S. rosmarinus en PR, fueron las pocas especies con ambos 20-carboxilo. y ATD de 20 epoxi (grupo E) en hojas (Figs. 2 y 5). Esta acumulación específica de especies de metabolitos relacionados con el ácido carnósico puede estar relacionada con la capacidad de resistir las duras condiciones climáticas en el hábitat mediterráneo66. Las hojas de estas especies mostraron una mayor expresión de CYP76AK que las raíces, lo que podría estar relacionado con la localización específica de los ATD 20-carboxilo y 20-epóxido en los cloroplastos de los órganos verdes fotosintéticos67,68. Anteriormente se especuló que el ácido carnósico era un posible intermediario para la desmetilación (C-20), lo que lleva a la formación de un puente heterocíclico entre C-20 y C-7. Esto, a su vez, sugirió que el grupo ácido carboxílico en el C-20 puede ser responsable de la aromatización del anillo B15, lo que en última instancia resulta en la producción de miltirona. Sin embargo, la acumulación de ácido carnósico fue estricta a ciertos órganos y especies, esto indica que no puede servir como precursor de las tanshinonas. En cambio, la hidroxilación (C-20) catalizada por CYP76AK1 y 22 demuestra una correlación más fuerte con la desmetilación y aromatización posteriores debido a su coexistencia y patrón de acumulación similar con las tanshinonas en el Clado IV. Esto representa un paso significativo en la investigación mecanicista del proceso de formación de tanshinonas, específicamente en la comprensión de los mecanismos de desmetilación y aromatización. Por lo tanto, la expresión variable de distintas CYP76AK entre clados evolutivos podría dirigir la evolución de la vía de biosíntesis de ATD, lo que resultaría en la producción específica de ATD en Salvia, como las tanshinonas y los metabolitos relacionados con el ácido carnósico.

Además, basándonos únicamente en la evidencia de actividad in vitro de CYP76AK, no podemos descartar la posibilidad de que otras enzimas participen en la oxidación consecutiva de los ATD. Similar a la vía biosintética de la artemisinina, aunque la evidencia in vitro muestra que CYP71AV1 puede catalizar la oxidación consecutiva de amorfa-4,-11-dieno en C-12 para formar aldehído artemisínico y ácido artemisínico, otras enzimas como la alcohol deshidrogenasa (ADH1) y La aldehído deshidrogenasa artemisínica (ALDH1) también participa en los dos últimos pasos de oxidación en las células glandulares de tricomas de Artemisia annua69,70,71. Esto también sugiere la posibilidad de la participación de otras enzimas, además de CYP76AK, en la oxidación del C-20 de los ATD en Salvia, lo que requiere más estudios funcionales in vivo de CYP76AK y el descubrimiento de nuevas enzimas.

Es la pérdida de actividad de las CYP76AK, más que la neofuncionalización, lo que ha impulsado la diversidad de ATD en el género Salvia. La diferenciación y expansión de CYP76AK causada por eventos de WGD no ha resultado en neofuncionalizaciones como en casos anteriores72 sino más bien en una pérdida de actividades en los taxones correspondientes (Fig. 6). Es interesante señalar que la pérdida de actividad también ha desencadenado cambios en las características estructurales y los patrones de distribución que resultan en diversidad metabólica, como la producción de tanshinonas y derivados del ácido carnósico. A diferencia de la mayoría de los casos, que han asumido que la innovación funcional es lo que conduce a la diversidad metabólica, los resultados de este estudio sugieren que la pérdida de actividades también puede actuar como un factor clave para la diversidad metabólica.

Por otro lado, con respecto a la divergencia funcional, las CYP76AK también exhiben patrones transcripcionales distintos, que eventualmente conducen a la acumulación específica de órganos completamente opuesta de derivados del ácido carnósico y tanshinonas. Sobre la base de esto, especulamos que las funciones fisiológicas y ecológicas de estos metabolitos pueden estar relacionadas con la divergencia metabólica presente en este género. Por ejemplo, el ácido carnósico y el carnosol se acumulan principalmente en los cloroplastos de los tejidos verdes, proporcionando así un mecanismo antioxidante único y eficaz en los tejidos fotosintéticos de estas plantas66. Se ha demostrado que el mecanismo de protección basado en el ácido carnósico es crucial para permitir que las especies de Salvia resistan las duras condiciones climáticas, mientras que las tanshinonas pueden estar involucradas en la interacción entre las raíces y los microorganismos del suelo circundante73,74.

Además, los distintos patrones de transcripción de cada clado CYP76AK representaron otro aspecto de la evolución de la función. Sus patrones específicos de órganos no son independientes, sino que están acompañados por otros genes catalíticos involucrados en la biosíntesis de derivados del ácido carnósico y tanshinonas como KSL, CYP76AH y CYP71D. Mientras tanto, tales patrones se mantienen en diferentes linajes de Salvia30,53,75, lo que plantea la cuestión del origen de sus transcripciones específicas de órganos como un tema de investigación adicional. En resumen, la diferenciación de ATD en Salvia proporciona un modelo completo que involucra múltiples especies, familias de genes, diversidad metabólica y evolución ecológica, lo que lo convierte en un objeto de investigación ideal para los mecanismos genéticos responsables de la diversidad química en las plantas.

Los estudios filogenéticos moleculares más recientes respaldan la presencia de 11 subclados en el género Salvia (subg. Audibertia, subg. Calosphace, subg. Dorystaechas, subg. Glutinaria, subg. Heterosphace, subg. Meriandra, subg. Perovskia, subg. Rosmarinus, subg. Salvia, subg. Sclarea y subg. Zhumeria)56,58,59,60. Se construyó un árbol filogenético de Salvia para obtener un esquema de muestreo para analizar la diversidad química entre estas especies (Datos complementarios 1). En total, se muestrearon 71 especies de tres principales centros de distribución de este género, que representan 8 de los 11 subclados reconocidos de Salvia. Se seleccionaron como grupos externos seis especies (M. officinalis, M. spicata, C. polycephalum, O. vulgare, N. cataria y P. vulgaris) de otras tribus Mentheae. Para obtener materiales suficientes para los análisis químicos y de transcriptoma, se recolectaron muestras en las etapas vegetativa o de floración. Se recolectaron tres órganos (raíces, tallos y hojas) en la etapa vegetativa y cuatro órganos (raíces, tallos, hojas y flores) en la etapa de floración. Para permitir el muestreo del mismo tipo de tejido para análisis químicos y transcriptomas, los tejidos de cada órgano se trituraron hasta obtener un polvo fino y se dividieron en alícuotas.

Para obtener transcripciones más completas, se realizó una estrategia de órganos mixtos para la construcción de bibliotecas, mediante la cual la base de datos de transcripciones generada se utilizó para estudios filogenéticos. Para el perfil de transcripción, se generaron bibliotecas para hojas y raíces individuales de plantas representativas de cada clado (es decir, S. rypara, S. karwinskii, S. madrensis, S. pachyphylla, S. apiana y S. columbariae del Clado II; S. castanea F. tomentosa, S. przewalskii, S. roborowskii, S. chinensis, S. trijuga, S. miltiorrhiza del Clado IV, S. deserta, S. roemeriana, S. officinalis subsp.lavandulifolia, S. officinalis del Clado I; S. rosmarinus de PR)47,48. El ARN total se aisló utilizando el kit de ARN TransZol Plus (TransGen Biotech, Beijing, China). Las bibliotecas de ADNc se prepararon utilizando el kit de preparación de muestras de ARN Illumina TruSeq (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.) y se secuenciaron en un secuenciador Illumina NovaSeq 6000, generando lecturas de extremos emparejados de 2 × 150 pb. Las lecturas fueron evaluadas y recortadas por fastp (https://github.com/OpenGene/fastp) con parámetros predeterminados. Los ensamblajes de transcripción se generaron utilizando el ensamblador Trinity76. Para la anotación del transcriptoma, se buscaron todas las transcripciones en las bases de datos del proteoma de Arabidopsis thaliana, SwissProt y Pfam utilizando BLASTX, BLASTP y HMMER v3.1b2 con un límite de valor e de 1E-5, respectivamente77. Los valores de expresión génica (transcripciones por millón de lecturas [TPM]) se calcularon mediante el software RSEM78. Esencialmente, el análisis de expresión diferencial se realizó utilizando DESeq279 con ajuste de p <0,05 y |log2FC|≥ 1 como umbral. Los mapas de calor de genes se generaron utilizando TBtools (//github.com/CJ-Chen/TBtools) con la función Heatmap Illustrator.

Todas las transcripciones ensambladas se filtraron para retener las isoformas de transcripción más largas y las secuencias de proteínas se predijeron adicionalmente utilizando TransDecoder v5.5.080. Se construyeron grupos ortólogos con OrthoFinder v2.5.481 utilizando secuencias de proteínas predichas por TransDecoder de las 77 especies. Teniendo en cuenta que el ensamblaje fragmentado, el ensamblaje incorrecto, los sitios informativos insuficientes y otros factores pueden dar como resultado inferencias sesgadas, los cinco conjuntos de genes, incluidos cuatro conjuntos de genes de baja copia, es decir, 2178 OG, 1532 OG, 1169 OG y 512 OG, y uno Se extrajo un conjunto de genes de copia única, es decir, 130 OG, para la construcción del árbol filogenético. Las secuencias de proteínas resultantes de conjuntos de genes de copia única/baja se alinearon con MAFFT v7.48782 usando la configuración predeterminada, y TrimAl v1.4 recortó las regiones mal alineadas. rev1583. El árbol filogenético de cada ortólogo de OG individuales se construyó utilizando RAxML-NG v1.0.384 con 100 réplicas bajo el modelo JTT + I + G4. Luego, se utilizó Astral v5.685 para concatenar los árboles de filogenia para cada uno de los cinco conjuntos de OG con 100 réplicas de RAxML para obtener los valores de BS de todos los nodos. Además, se concatenaron 130 OG en una supermatriz y la relación filogenética final se reconstruyó utilizando RAxML-NG v1.0.384 con 1000 réplicas bajo el modelo JTT + I + G4. Entre las 77 especies, se eligieron como grupos externos M. officinalis, M. spicata, C. polycephalum, O. vulgare, N. cataria y P. vulgaris.

Se empleó MCMCTree en el paquete PAML v4.986 para la inferencia bayesiana de la estimación temporal divergente de especies candidatas. Se utilizó como árbol de entrada la topología de las especies candidatas de la reconstrucción ML con los 130 OG concatenados. Las secuencias de nucleótidos resultantes con modelos de sustitución de codones se alinearon y recortaron con MAFFT v7.48782 y el parámetro "backtrans" de TrimAl v1.4. rev1583. En primer lugar, se midieron las longitudes de las ramas y la tasa de sustitución general (rgene gamma) utilizando el programa BASEML en el paquete PAML v4.986 bajo el modelo GTR + G. En segundo lugar, el tiempo divergente se estimó utilizando MCMCtree y los parámetros de burn-in, sampfreq y nSample se establecieron en 500.000, 150 y 10.000, respectivamente. El tiempo de divergencia de las especies candidatas de Salvia se estimó basándose en las siguientes limitaciones de edad de los fósiles: 11-27 millones de años para los divergentes de C. polycephalum y M. spicata, y 21-47 millones de años para los divergentes entre M. officinalis y los otros grupos externos. es decir, N. cataria, C. polycephalum, M. spicata, O. vulgare y P. vulgaris. Por último, múltiples iteraciones de la estimación de MCMCTree hicieron que la desviación del tiempo divergente fuera <0,1%.

Las distribuciones de edad basadas en KS para los parálogos de todas las especies candidatas se construyeron utilizando el proceso "wgd"87. Brevemente, los parálogos de cada especie se identificaron utilizando la herramienta de búsqueda de similitud de secuencia Diamond v0.9.18.119 con un límite de valor E de 1E-1088. Las familias de genes parálogos se agruparon utilizando el algoritmo de agrupación de Markov89. Los genes dentro de cada familia de genes parálogos se alinearon utilizando MAFFT v7.48782 con los parámetros predeterminados, respectivamente. Los valores de KS de todos los pares de genes parálogos dentro de una familia de genes se midieron utilizando el programa CodeML en el paquete PAML v4.986. Posteriormente, los valores de KS se ponderaron por nodos para corregir la redundancia con la construcción del árbol filogenético para cada familia utilizando FastTree v2.1.790. La distribución de envejecimiento de KS de los parálogos de todas las especies analizadas se muestra en las barras grises de la Figura complementaria 7.

Dadas las diferentes tasas de sustitución de todas las especies probadas, los eventos WGD específicos o compartidos por especies se ajustaron aún más utilizando un árbol basado en KS. Aquí, se utilizaron 130 genes de copia única de OrthoFinder v2.5.481 para todas las especies analizadas para calcular las longitudes de las ramas de la filogenia en la unidad KS usando el programa CodeML en el paquete PAML v4.986 con un modelo de proporción libre.

Los genes con el dominio Pfam de PF00067 se identificaron como miembros de la familia CYP450. Siete genes CYP76AK conocidos (SmCYP76AK1: KR140169.1, S. miltiorrhiza; SmCYP76AK2: KP337688.1, S. miltiorrhiza; SmCYP76AK3: KP337689.1, S. miltiorrhiza; SfCYP76AK6: KX431218.1, S. fruticosa; SpCYP76 AK6: KT157045.1 , S. pomifera; SrCYP76AK7: KX431219.1, S. rosmarinus; y SrCYP76AK8: KX431220.1, S. rosmarinus) se descargaron de la base de datos del NCBI como una base de datos local CYP76AK. Se realizaron búsquedas BLASTP para identificar los genes CYP76AK correspondientes con un valor de corte E de 1E-5. Las secuencias de proteínas de los genes CYP450 seleccionados que codificaban proteínas de ≥466 aminoácidos se alinearon y recortaron utilizando MAFFT v7.48782 y TrimAl v1.4. rev1583, respectivamente. La filogenia de los genes CYP76AK se infirió utilizando el gen CYP76AH1 como grupo externo mediante ModelTest-NG v0.1.791 y RAxML-NG v1.0.37684. Para los genes CYP450 que codificaban proteínas de <466 aminoácidos, se utilizaron búsquedas BLASTP para clasificar los genes candidatos.

Según el árbol filogenético anterior, la datación molecular de CYP76AK de diferentes especies se analizó utilizando MCMCTREE del paquete PAML v4.986 bajo el modelo GTR + G (modelo = 7) con 500.000 iteraciones y 150 frecuencias de muestreo, después de 500.000 iteraciones como quemado. -en. La tasa de sustitución, es decir, el gen gamma, se calculó como G (1, 5,95) utilizando BASEML del paquete PAML v4.986. Se utilizaron el nodo de la corona de dos familias de genes de copia única (es decir, CYP76AK3 y 22) y dos familias de genes específicos de especie (es decir, CYP76AK1 y 6) para estimar el tiempo divergente de cada nodo. Utilizamos las siguientes restricciones de edad para cada procedimiento de estimación: una edad mínima y máxima de 23,7 y 35,2 millones de años para el nodo de la corona de CYP76AK3 (el tiempo de divergencia de S. abrotanoides y otras especies); una edad mínima y máxima de 21,8 y 32,9 millones de años para el nodo de la corona de CYP76AK22 (el tiempo de divergencia de S. rosmarinus y otros); una edad mínima y máxima de 14,3 y 22,5 millones de años para el nodo de la corona de CYP76AK6 (el tiempo de divergencia del Clado I y otros); una edad mínima y máxima de 6,7 y 11,8 millones de años para el nodo de la corona de CYP76AK1 (el tiempo de divergencia del Clado IV y otros).

Los bloques de síntesis entre cada par de especies candidatas (N. cataria, S. rosmarinus, S. miltiorrhiza, S. bowleyana, S. hispanica y S. splendens) se realizaron utilizando MCScan (versión Python). Los CYP76AK objetivo o los genes vecinos se eligieron como semillas para buscar bloques sintéticos de evolución conservada.

Utilizando el archivo de secuencia coincidente, el archivo de árbol filogenético y el archivo de control configurado, se utilizó el modelo JTT + GAMMA del programa CodeML en el paquete PAML v4.986 para estimar la secuencia ancestral hipotética de los miembros de la subfamilia CYP76AK. Las regiones con brechas de alineación se analizaron mediante el método de parsimonia para determinar la base de residuos ancestrales. Luego se sintetizaron los genes ancestrales estimados y se optimizaron los codones para la identificación funcional en S. cerevisiae.

Con base en los resultados metabólicos y la investigación bibliográfica39, se codificaron los tipos de composición de especies de Salvia. Los tipos de componentes están codificados en 6 estados: ninguno (A); AT (B); ATD 20-ceto (C); TA y ATD 20-ceto (D); CA y ATD 20-ceto (E); TA, CA y ATD 20-ceto (F). Tomando el árbol evolutivo (ML) con información sobre la longitud de las ramas como árbol de entrada, se utilizó el análisis estadístico de dispersión-vicarianza (S-DIVA) del software Reconstruct Ancestral State in Phylogenies (RASP) para inferir estados ancestrales de tipos de componentes y calcular señales filogenéticas92.

Los estándares químicos se adquirieron de Shanghai Standard Technology Co., Ltd. (Shanghai, China). Los demás productos químicos y reactivos se adquirieron de la siguiente manera: acetonitrilo y metanol (grado HPLC; Merck, Darmstadt, Alemania), warfarina (Sigma-Aldrich, Madrid, España), cloroformo (Sinopharm Chemical Reagent, Shanghai, China), leucina encefalina (Waters , Milford, MA, EE. UU.), agua destilada pura (Watsons Water, Hong Kong, China) y ácido fórmico (grado HPLC; Fisher Scientific, Fairlawn, Nueva Jersey, EE. UU.).

Cada planta se separó en muestras de raíz y hoja, con tres réplicas biológicas. Todas las muestras se molieron hasta obtener un polvo fino y se extrajeron 10 mg del polvo preparado con 1 ml de metanol al 70 % (v/v) que contenía warfarina (5 μg/ml) como referencia interna durante 1 h en un baño ultrasónico (53 kHz). , 350 W) a 4 °C. Después de centrifugar a 12.000 x ga 4 ° C durante 30 minutos, el sobrenadante se utilizó para el análisis UHPLC-QTOF-MS.

Para el análisis metabólico se utilizó un sistema Acquity UPLC (Waters, Milford, MA, EE. UU.) junto con un espectrómetro de masas Xevo G2-XS QTOF (Waters, Milford, MA, EE. UU.). Las muestras se separaron primero utilizando una columna Acquity UPLC T3 (2,1 mm x 100 mm, 1,8 μm). La temperatura de la columna se mantuvo constante a 40 °C y el caudal fue de 0,40 ml/min con un volumen de inyección de 1,0 µl. Las fases móviles para la elución en gradiente consistieron en 0,1% (v/v) de ácido fórmico/agua (disolvente A) y 0,1% (v/v) de ácido fórmico/acetonitrilo (disolvente B). Los gradientes de elución fueron 98–80% A durante 0–7 min, 80–78% A durante 7–11 min, 78–40% A durante 11–20 min, 40–35% A durante 20–25 min, 25– 28 min al 35% A, 35–5% A durante 28–30 min, 30–33 min al 5% A y reequilibrio final al 98% A durante 5 min.

Se utilizó un Xevo G2-XS con una fuente de ionización por electropulverización para recopilar datos de MS. La MS se realizó tanto en modo de iones positivos como de iones negativos bajo un voltaje de cono de 30 V, con un voltaje capilar de 3,0 kV (modo de iones positivos) o 2,5 kV (modo de iones negativos). La temperatura de desolvatación se fijó en 450 °C con un caudal de gas de desolvatación de 600 L/h, y la temperatura de la fuente se fijó en 150 °C con un caudal de gas de cono de 50 L/h. Todos los datos se recopilaron en el modo MSE, con los siguientes parámetros: rango MSE, 50–1200 m/z; MSE de baja energía, 6 eV; y MSE de alta energía, 15 a 30 eV. Para calibrar el instrumento se utilizó una solución de formiato de sodio (0,5 mM). La adquisición continua de leucina encefalina se utilizó como estándar externo para la corrección de masa. Todos los datos se vieron en MassLynx v4.2 (Waters, Milford, MA, EE. UU.).

Los datos sin procesar se convirtieron primero al formato del archivo base de análisis (ABF Converter; https://www.reifycs.com/AbfConverter/) antes de importarlos al software MS-DIAL v4.6093. Los ajustes de los parámetros fueron los siguientes: las tolerancias para MS1 y MS2 fueron 0,01 Da y 0,02 Da, respectivamente. El rango de masa de MS1 y MS/MS se estableció entre 100 y 1000, con el límite de amplitud de MS/MS en 800. El rango de tiempo de retención se estableció entre 1,0 y 29,5 min, con una tolerancia del tiempo de retención de 0,15 min. La anchura del corte de masa fue de 0,1 Da. Tipos de aductos como [MH]−, [M + HCOO]−, [M+Na-2H]−, [M + K-2H]−, [2M-H]− y [2 M + FA-H] - fueron seleccionados para el modo de iones negativos. [M + H]+, [M+Na]+, [M + K]+, [M + NH4]+ y [2 M + H]+ se seleccionaron para el modo de ion positivo. Cada una de las tablas de características obtenidas se dividió en dos tablas de picos según los rangos de tiempo de retención, que fueron de acuerdo con el nivel de acumulación de ácidos fenólicos (1,0 a 18,5 min para muestras de raíces y hojas) y ATD (16,5 a 29,5 min para muestras de raíces y hojas). muestras; 14,0–29,5 min para muestras de hojas). Los datos de metabolómica normalizada se importaron a SIMCA-P 14.1 (Umetrics AB, Umea, Suecia) para realizar el análisis quimiométrico.

Con base en los datos de secuenciación del genoma y del transcriptoma, todos los genes CYP76AK candidatos se identificaron y clonaron utilizando los cebadores que se muestran en los Datos complementarios 12. Los marcos de lectura abiertos se subclonaron aún más en el vector pESC-His etiquetado con epítopo utilizando los sitios de restricción EcoR I y Not I. para expresión en la cepa de levadura WAT11, que contiene A. thaliana NADPH-CYP reductasa ATR194. Como control se empleó WAT11 transformado con pESC-His vacío. Los transformantes se cultivaron en medio de eliminación SD (-His) y se cultivaron a 28 °C durante 72 h. Inicialmente se cultivó una única colonia positiva en 5 ml de medio líquido SD-His durante aproximadamente 24 h a 28 °C en una incubadora con agitación (200 rpm). Luego, el cultivo se usó para inocular 250 ml de medio líquido SD-His fresco durante otras 24 h a 28 °C con agitación. Luego, las células se recogieron y se lavaron tres veces con agua esterilizada y extracto de levadura en medio de peptona dextrosa con galactosa al 2% (YPL). Luego las células se indujeron con YPL con agitación durante 16 h a 28 °C. Se preparó una solución tampón Tris-EDTA con Tris-HCl 50 mM y EDTA 1 mM a pH 7,4. Las células se recuperaron y se transfirieron a un tubo de 50 ml mediante centrifugación a 7000 x g durante 5 minutos y se resuspendieron en 25 ml de tampón TEK (KCl 0,1 M en tampón TE). Luego, las células se dejaron a temperatura ambiente durante 5 minutos y se recuperaron nuevamente y se resuspendieron en TESB previamente enfriado (sorbitol 0,6 M en TE). Luego, todos los pasos se realizaron a 4 °C. Las células se lisaron a 4-6 ° C mediante un disruptor celular de flujo continuo de presión ultra alta y baja temperatura. El procedimiento se repitió tres veces. Luego, el tubo se centrifugó a 12.000 x g durante 30 minutos y el sobrenadante se transfirió a tubos que contenían 10 ml de polietilenglicol (PEG) -NaCl (PEG4000 y NaCl 0,15 M). El tubo se centrifugó nuevamente a 12.000 x g durante 30 min. Se descartó el sobrenadante y el sedimento se resuspendió en tampón TEG (5% [v/v] de glicerol en tampón TE).

Los ensayos de actividad se realizaron en un microtubo de 1,5 ml utilizando 500 µL de tampón TE (pH 7,5) que incluía 0,5 mg de proteínas microsomales totales, NADPH 300 µM, 50 µM de sustrato y un sistema de regeneración (FAD 2,5 µM, FMN 2,5 µM, 1 mM de DTT, 2 mM de glucosa-6-fosfato y 2 U de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa). Las mezclas de reacción se incubaron a 28 °C durante 16 h en una incubadora con agitación (200 rpm) y luego se extrajeron con 500 μL de acetato de etilo tres veces con agitación vortex. Después de la centrifugación a 12.000 x g durante 10 minutos, la fase orgánica se transfirió a microtubos nuevos, se concentró al vacío y se resuspendió en 200 μl de metanol para análisis LC-MS.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan los hallazgos de este trabajo están disponibles en el documento y en los archivos de información complementaria. Un resumen del informe de este artículo está disponible como archivo de información complementaria. Los conjuntos de datos generados y analizados durante este estudio están disponibles a pedido del autor correspondiente. Todos los datos de espectrometría de masas involucrados en este estudio se han depositado en la Enciclopedia Nacional de Datos Ómicos con el ID del proyecto: OEP004258. Los datos del transcriptoma involucrados en este estudio se depositaron en la base de datos Genome Sequence Archive (CRA010533), a la que se puede acceder públicamente en https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa. Se utilizaron archivos HMM de Pfam para predecir las familias de genes CYP450 (PF00067). Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Los autores agradecen al Dr. David Nelson (Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Tennessee) del comité de nomenclatura del P450 por nombrar los P450. Agradecemos al Sr. Jun Zhang de Kunming Plant Classification Biotechnology Co., Ltd. por la recolección e identificación de especies. También agradecemos al Dr. Pan Liao de la Universidad Bautista de Hong Kong por sus valiosos consejos sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado financieramente por el Programa Nacional Clave de I+D de China (2022YFC3501700), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31970325, 32070327), el Programa de Patrocinio de Jóvenes Científicos de Élite de Cast (2021-QNRC1-02) y el Proyecto de Investigación de Ciencia y Comisión de Tecnología de la Municipalidad de Shanghai (21DZ2202300).

Estos autores contribuyeron igualmente: Jiadong Hu, Shi Qiu, Feiyan Wang, Qing Li.

Laboratorio clave SATCM para nuevos recursos y evaluación de la calidad de la medicina china, Instituto de Materia Médica China, Universidad de Medicina Tradicional China de Shanghai, Shanghai, 201203, China

Jiadong Hu, Shi Qiu, Feiyan Wang, Ziding Wu, Rui Jiang, Jinxing Li, Zhen Zeng, Jing Wang, Xingxing Wang, Yuchen Zhang, Shiyuan Fang, Yuqi Qiao, Junfeng Chen y Wansheng Chen

Departamento de Farmacia, Segundo Hospital Afiliado de la Universidad Médica de la Marina, Shanghai, 200003, China

Jiadong Hu, Qing Li y Wansheng Chen

Laboratorio clave de CAS para la diversidad vegetal y la biogeografía del este de Asia, Instituto de Botánica de Kunming, Academia de Ciencias de China, Kunming, 650201, China

Chun-Lei Xiang

Centro Estatal Local Conjunto de Investigación de Ingeniería para el Mejoramiento y Aplicación del Ginseng, Facultad de Materiales Medicinales Chinos, Universidad Agrícola de Jilin, Changchun, 130118, China

Peng Di

Centro de Investigación y Extensión de Horticultura Urbana, Jardín Botánico Chenshan de Shanghai, Shanghai, 201602, China

Jie Ding y Yun Jiang

Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad Forestal del Noreste, Harbin, 150040, China

Zhichao Xu

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WSC, JFC, SQ y JDH planificaron y diseñaron la investigación. JDH, FYW, RJ, JXL, ZZ, SYF, YQQ, JD, YJ prepararon el material vegetal para la secuenciación y el perfil químico. C.-LX identificó todas las especies. ZCX, QL y PD realizaron los análisis bioinformáticos. SQ y FYW analizaron los datos metabólicos. JDHZDW, JW, XXW y YCZ llevaron a cabo experimentos. JDH, FYW, ZCX, QL, SQ, JFC y WSC interpretaron los datos y participaron en la discusión. JDH, ZCX, SQ y JFC, escribieron el artículo. WSC revisó el documento. Los autores JDH, SQ, FYW y QL contribuyeron igualmente a este trabajo.

Correspondencia a Shi Qiu, Zhichao Xu, Junfeng Chen o Wansheng Chen.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Benjamin Lichman y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado al autor(es) original(es) y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Hu, J., Qiu, S., Wang, F. et al. La divergencia funcional de CYP76AK da forma a la quimiodiversidad de los diterpenoides de tipo abietano en el género Salvia. Nat Comuna 14, 4696 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40401-y

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Recibido: 20 de enero de 2023

Aceptado: 26 de julio de 2023

Publicado: 04 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40401-y

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