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Apr 24, 2024

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12664 (2023) Citar este artículo

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La infertilidad o subfertilidad es una barrera crítica para la producción ganadera sostenible, incluidas las novillas. El desarrollo de novillas que no producen un ternero en un plazo óptimo es un factor crítico para la rentabilidad y sostenibilidad de la industria ganadera. Paralelamente, las novillas son un excelente modelo biomédico para comprender la etiología subyacente de la infertilidad porque las novillas bien alimentadas aún pueden ser infértiles, principalmente debido a causas fisiológicas y genéticas inherentes. Utilizando un chip de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) de alta densidad, recopilamos datos genotípicos, que se analizaron mediante un análisis de asociación en PLINK con la prueba exacta de Fisher. También produjimos datos cuantitativos del transcriptoma y datos del proteoma. Los datos del transcriptoma se analizaron mediante la prueba de cuasi verosimilitud seguida de la prueba de Wald, y la prueba de probabilidad y los datos del proteoma se analizaron mediante un modelo mixto generalizado y la prueba t de Student. Identificamos dos SNP significativamente asociados con la fertilidad de las novillas (rs110918927, chr12: 85648422, P = 6,7 × 10−7; y rs109366560, chr11:37666527, P = 2,6 × 10−5). Identificamos dos genes con abundancia diferencial de transcripción (eFDR ≤ 0,002) entre los dos grupos (fértil y subfértil): proteína asociada a la membrana plasmática de adipocitos (APMAP, 1,16 mayor abundancia en el grupo fértil) y cadena intermedia axonemal 7 de dineína (DNAI7, 1,23 mayor abundancia en el grupo Sub-Fértil). Nuestro análisis reveló que la proteína dioxigenasa FTO dependiente de alfa-cetoglutarato era más abundante en el plasma recolectado de novillas fértiles en comparación con sus contrapartes subfértiles (FDR <0,05). Por último, un análisis integrador de los tres conjuntos de datos identificó una serie de características moleculares (SNP, transcripciones de genes y proteínas) que discriminaron correctamente a 21 de 22 novillas según su categoría de fertilidad. Nuestros análisis multiómicos confirman la naturaleza compleja de la fertilidad femenina. Muy importante, nuestros resultados también resaltan diferencias en el perfil molecular de las novillas asociadas con la fertilidad que trascienden las limitaciones de los antecedentes genéticos específicos de la raza.

Los últimos datos de la Organización para la Agricultura y la Alimentación muestran que en 2020 más del 46% del suministro diario de proteínas en el mundo provino de alimentos de origen animal (FAO-STATS). La carne y la leche de bovino representaron el 12,8% del suministro total de proteínas en el mundo en 2020 (FAO-STATS). Estas cifras subrayan la importancia de la producción ganadera para sostener una demanda creciente de proteínas a nivel mundial1. La infertilidad o subfertilidad es una barrera crítica para la producción ganadera sostenible2, incluso en el caso de las novillas. Por ejemplo, aproximadamente el 15%3 y el 5%4 de las novillas para carne y leche, respectivamente, no paren a los 24 meses de edad. Las novillas que paren en una edad óptima tienen mayor productividad y longevidad en el rebaño5,6,7,8,9,10. Por lo tanto, identificar novillas con fertilidad óptima es un enfoque prometedor para mejorar la sostenibilidad en la producción ganadera.

La heredabilidad de los valores genéticos para la fertilidad de las novillas es a menudo baja para las novillas de carne11,12,13,14,15,16,17 y lecheras18,19,20,21,22,23, lo que indica que existen múltiples factores genéticos que afectan este complejo. rasgo más allá de los efectos genéticos aditivos. Otra posible vía para comprender la infertilidad es el uso del fenotipado molecular24. Los esfuerzos pioneros se centraron en estudios de asociación de todo el genoma (GWAS) para identificar marcadores genéticos asociados con la fertilidad de las novillas4,12,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37. 38, pero sólo unos pocos parecen ser reproducibles entre poblaciones37. Los esfuerzos más recientes también se han centrado en los conjuntos de datos del transcriptoma39,40,41 y del metaboloma42 que caracterizan estas moléculas en muestras de sangre. Nuevamente, se han identificado genes limitados con abundancia diferencial de transcripciones en todos los conjuntos de datos39. Se necesita mucha investigación para la identificación de características moleculares que puedan ayudar a explicar la aptitud para la fertilidad.

En total, aproximadamente el 5% de las novillas son infértiles4,43, y esta cohorte es un gran modelo biológico para estudiar las bases genéticas de la infertilidad por varias razones. En primer lugar, ni las novillas lecheras ni las de carne están sometidas a la exigente demanda metabólica necesaria para la producción de leche44,45,46. En segundo lugar, las vacas posparto necesitan pasar por un período crítico de recuperación fisiológica y anatómica antes de la próxima inseminación47,48,49. En tercer lugar, existen varias enfermedades posparto con consecuencias negativas sobre el éxito reproductivo50,51,52. Los problemas reproductivos en novillas bien manejadas son inherentes a su fisiología20, la mayoría de las cuales también están bajo control genético53, o directamente relacionadas con mutaciones54 que perjudican las funciones reproductivas femeninas.

Las novillas Angus y Holstein tienen frecuencias similares de infertilidad o subfertilidad4,43 a pesar de las presiones de selección dirigidas a la producción de carne o leche y, por lo tanto, tienen antecedentes genéticos distantes. La mayoría de los estudios que involucran la identificación de características biológicas asociadas con la fertilidad en novillas han utilizado un grupo de animales de raza pura o cruzados4,12,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36, 37,38,39,40,41,42. En este caso, llevamos a cabo un experimento de casos y controles55 para probar la hipótesis de que las diferencias en las variantes genéticas, la transcripción genética y la abundancia de proteínas debido a la aptitud para la fertilidad serían compartidas entre novillas de diferentes orígenes genéticos. Nuestro objetivo fue contrastar variantes genéticas, transcripciones genéticas y abundancia de proteínas entre novillas fértiles y subfértiles de orígenes genéticos Angus y Holstein. Mostramos que tanto el análisis independiente como el enfoque multiómico identificaron firmas moleculares capaces de discriminar novillas con diferente potencial de fertilidad y, por lo tanto, con una biología subyacente asociada con la fertilidad que se comparte entre ambas razas.

Todos los procedimientos analíticos se presentan en el archivo adicional 1 y se puede acceder a ellos en https://biase-lab.github.io/MultiOmics/.

El manejo de animales para este experimento fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Instituto Politécnico y la Universidad Estatal de Virginia.

Recolectamos muestras de sangre de novillas Angus de raza pura (n = 12), con una edad promedio de 14 meses, en el momento de su primer servicio de inseminación artificial (IA). Las novillas fueron sometidas a un protocolo de sincronización de estro Co-Synch + CIDR de 7 días antes del servicio. Brevemente, a las novillas se les administró una inyección intramuscular (IM) de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH, 100 μg; Factrel®; Zoetis Inc.) el día 0, seguida de la inserción de un fármaco de liberación interna controlada (CIDR, 1,38 g de progesterona; Eazi-Breed™ CIDR®; Zoetis Inc.). El día 7, se retiró el CIDR y se administró una inyección de prostaglandina F2 alfa (PGF2α, 25 μg; Lutalyse®; Zoetis Inc.). La IA de tiempo fijo se realizó 54 ± 2 h después de la eliminación del CIDR junto con una segunda inyección de GnRH.

Además, recolectamos muestras de sangre de novillas Holstein de raza pura (n = 10), con una edad promedio de 12 meses, en el momento del primer servicio de IA. Las novillas se inscribieron en un protocolo CIDR-Synch de 5 días antes de la inseminación. Brevemente, se administró una inyección IM de GnRH el día 0 con la inserción de un dispositivo CIDR. El dispositivo CIDR se retiró el día 5, seguido de una inyección IM de PGF2α. Se administró una segunda inyección de PGF2α 24 horas después. Luego, se realizó una IA cronometrada con una segunda inyección de GnRH el día 8.

Las novillas fueron identificadas como Fértiles (Holstein, n = 5; Angus, n = 5) o Subfértiles (Holstein, n = 5; Angus, n = 7) según el resultado de su embarazo, siguiendo criterios similares utilizados anteriormente39,40. Los animales fértiles fueron identificados como aquellos que quedaron preñados y posteriormente dieron a luz una cría después del primer servicio de inseminación. Las novillas Angus fueron categorizadas como subfértiles después de no lograr la preñez luego de dos servicios de inseminación y exposición a un toro para reproducción natural. Las novillas Holstein fueron identificadas como subfértiles después de necesitar cuatro o más inseminaciones artificiales.

Las novillas se sincronizaron con protocolos que, según investigaciones previas, tienen un gran éxito para que una novilla quede preñada con IA56,57. De ahí los diferentes protocolos para novillas de carne y leche. Los criterios de clasificación fueron diferentes para cada grupo debido a las diferencias en el manejo inherentes a las novillas de reemplazo para carne y leche. Lo más importante es que cada novilla tuvo múltiples oportunidades de quedar preñada antes de ser clasificada como subfértil.

Las novillas utilizadas en este estudio no formaron parte de un experimento nutricional y, por lo tanto, la nutrición no se consideró como una variable ni fue un factor en la selección de las novillas. Todas las novillas lecheras fueron criadas con una exposición equivalente al alimento. De manera similar, todas las novillas para carne fueron criadas con una exposición equivalente al alimento.

Se extrajeron cincuenta ml de sangre de cada animal mediante venopunción de la vena yugular utilizando vacutainers K2 EDTA de 18 mg (Becton, Dickinson y Company). Los tubos se invirtieron para una mezcla adecuada con el anticoagulante y luego se colocaron inmediatamente en hielo hasta su posterior procesamiento.

Procesamos las muestras de sangre siguiendo los procedimientos descritos en otros lugares39,40,58 dentro de las tres horas posteriores al muestreo58. Los tubos que contenían muestras de sangre completa se centrifugaron durante 25 minutos (min) a 4 °C y 2000 xg para separar la capa leucocitaria. Luego se aspiró la capa leucocitaria y se mezcló con 14 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (cloruro de amonio 1,55 M, bicarbonato de sodio 0,12 M, EDTA 1 mM (Protocolos Cold Spring Harbor)). Luego, la solución se centrifugó durante 10 min a 4 °C a 800 xg y se descartó el sobrenadante. El sedimento restante se mezcló con 200 µl de reactivo TRIzol™ (Invitrogen™, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) en un criotubo de 2 ml (Corning Inc., Corning, NY) antes de congelarlo rápidamente con nitrógeno líquido. Luego, las muestras se almacenaron a –80 °C hasta su posterior procesamiento.

Las muestras de capa leucocítica se descongelaron a temperatura ambiente en un volumen total de 525 µl de reactivo TRIzol™. Luego, se extrajo el ARN total de los glóbulos blancos periféricos utilizando el kit Zymo Research Direct-zol™ DNA/RNA Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, CA), según el protocolo del fabricante. A continuación, evaluamos la calidad del ARN cuantificando el número de integridad del ARN (RIN) para cada muestra utilizando el kit Agilent RNA 6000 Pico (Agilent, Santa Clara, CA) en el bioanalizador Agilent 2100 (Agilent, Santa Clara, CA).

Enviamos 400 ng de ADN de cada novilla a Neogen (Neogen Corporation, Lincoln, NE) para su genotipado. Las muestras se genotiparon utilizando la matriz de genotipado Illumina BovineHD Beadchip (Illumina Inc., San Diego, CA) (777K). Procesamos los datos para el control de calidad59 utilizando PLINK60. Primero, eliminamos los SNP que se llamaron preferentemente en uno de los grupos del caso y del control. A esto le siguió la eliminación de muestras a las que les faltaban más del 10% de los genotipos y la eliminación de SNP con una frecuencia alélica menor inferior al 1%, una tasa de faltante superior al 10% o una desviación del equilibrio de Hardy-Weinberg (P < 0,00001). A continuación realizamos podas variantes. Consideramos un tamaño de ventana de 50 kilobases con cinco variantes en cada ventana con un umbral de correlación de 0,2. Después de la poda, calculamos los coeficientes de parentesco y consanguinidad utilizando el parámetro '--make-rel' en PLINK (archivo adicional 2). Todas las coordenadas SNP informadas son relativas al ensamblaje btau9 convertido con la herramienta LiftOver61.

Para la construcción de la biblioteca de secuenciación, se diluyeron 900 ng de ARN total en 25 µl de agua libre de nucleasas y la cantidad de ARN se confirmó utilizando el kit de ensayo de alta sensibilidad de ARN Qubit™ (Invitrogen™, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) en el Qubit. ™ 4 Fluorómetro (Invitrogen™, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Las bibliotecas se prepararon para la secuenciación de próxima generación utilizando el kit Illumina Stranded mRNA Prep (Illumina, Inc., San Diego, CA) y el IDT® para índices Illumina RNA UD (Illumina, Inc., San Diego, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. instrucciones. La secuenciación se realizó en el sistema de secuenciación NovaSeq 6000 (Illumina, Inc., San Diego, CA) utilizando el kit de reactivos NovaSeq 6000 SP v1.5 (Illumina, Inc., San Diego, CA) para producir lecturas de extremos emparejados de 150 nucleótidos en longitud. La secuenciación fue realizada por el laboratorio VANTAGE del Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt (Nashville, TN).

Alineamos las secuencias con el genoma de referencia del ganado (Bos_taurus.ARS-UCD1.2.105) en la base de datos Ensembl62 con hisat263,64,65 usando el parámetro muy sensible. Luego, utilizamos Samtools66,67 para filtrar secuencias y eliminar alineaciones secundarias, duplicados y lecturas no asignadas. A continuación, utilizamos biobambam268 para marcar y eliminar duplicados.

El número de fragmentos que coincidían con la anotación del gen de la vaca Ensembl62 (Bos_taurus.ARS-UCD1.2.105) se cuantificó utilizando featureCounts69, y conservamos genes anotados como codificadores de proteínas, pseudogenes o ARN largo no codificante. Luego se retuvieron los genes para análisis adicionales si los recuentos por millón (CPM) y los fragmentos por kilobase por millón (FPKM) eran >1 en al menos cinco muestras.

Se enviaron cien µl de plasma por muestra a las instalaciones de la Incubadora de Espectrometría de Masas de Virginia Tech (VT-MSI) en el Instituto de Ciencias de la Vida Fralin, Virginia Tech, para la extracción de proteínas y la recopilación de datos.

Las muestras de plasma (100 µl) se acidificaron mediante la adición de 11,1 µl de ácido o-fosfórico al 12 % (v/v) (MilliporeSigma, St. Louis, MO), luego las proteínas se precipitaron mediante la adición de 725 µl de metanol grado LC/MS. y se incubaron a -80°C durante la noche. La proteína precipitada se recogió mediante centrifugación y se solubilizó en tampón de lisis S-trap (SDS al 10 % (p/v) en bicarbonato de trietilamonio 100 mM (MilliporeSigma, St. Louis, MO, pH 8,5)). La concentración de proteína se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm, luego se redujeron 150 μg de proteína para cada muestra usando DTT (4,5 mM) y luego se alquilaron con yodoacetamida (10 mM, MilliporeSigma, St. Louis, MO). La yodoacetamida I sin reaccionar se inactivó con DTT (10 mM, MilliporeSigma, St. Louis, MO) y las muestras se acidificaron usando ácido o-fosfórico (MilliporeSigma, St. Louis, MO). La proteína se precipitó nuevamente usando metanol y se incubó a -80ºC durante la noche como se indicó anteriormente. La proteína precipitada se cargó en una micro trampa S y se lavó con metanol y luego se digirió durante la noche con tripsina. Se recuperaron los péptidos y cinco µg, según se determinó midiendo la absorbancia a 215 nm usando un espectrofotómetro/fluorómetro DS-11 FX+ (DeNovix, Wilmington, DE), de cada muestra se analizaron dos veces (duplicados) usando ESI-MS/MS Orbitrap Fusion. Lumos (Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)).

Las muestras se cargaron primero en una precolumna (Acclaim PepMap 100 (Thermo Scientific, Waltham, MA), 100 µm × 2 cm) después de lo cual el flujo se desvió a una columna analítica (50 cm µPAC (PharmaFluidics, Woburn, MA). El UPLC/ El muestreador automático utilizado fue un Easy-nLC 1200 (Thermo Scientific, Waltham, MA). El caudal se mantuvo a 150 nl/min y los péptidos se eluyeron utilizando un gradiente del 2 al 45 % de disolvente B en disolvente A durante 88 minutos. el emisor Easy-Spray compatible con µPAC (PharmaFluidics, Woburn, MA) era de 1300 voltios, el tubo de transferencia de iones se mantuvo a 275 °C, la lente de RF se configuró al 30% y el estado de carga predeterminado se estableció en 3.

Los datos de MS para el rango m/z de 400 a 1500 se recopilaron utilizando el orbitrap con una resolución de 120 000 en modo de perfil positivo con un objetivo de AGC de 4,0e5 y un tiempo de inyección máximo de 50 ms. Los picos se filtraron para el análisis MS/MS basándose en la distribución de picos isotópicos esperada de un péptido con una intensidad superior a 2,0e4 y un estado de carga de 2 a 5. Los picos se excluyeron dinámicamente durante 15 s después de 1 escaneo con la MS/MS configurada para recolectarse al 45% del ancho de un pico cromatográfico con un ancho de pico esperado (FWHM) de 15 s. Los datos de MS/MS a partir de m/z de 150 se recopilaron utilizando el orbitrap con una resolución de 15000 en modo centroide positivo con un objetivo de AGC de 1,0e5 y un tiempo de inyección máximo de 200 ms. El tipo de activación fue HCD escalonado de 27 a 33.

Los datos se analizaron utilizando Proteome Discoverer 2.5 (Thermo Scientific, Waltham, MA) combinando una búsqueda Sequest HT y Mascot 2.7 (Matrix Science, Boston, MA) en un resumen de resultados para cada muestra. Ambas búsquedas utilizaron la base de datos de proteoma Bos taurus de referencia de UniProt y una base de datos de contaminantes de proteínas común proporcionada con el paquete de software Proteome Discoverer (PD)70. Cada búsqueda asumió péptidos específicos de tripsina con la posibilidad de 2 escisiones perdidas, una tolerancia de masa de precursor de 10 ppm y una tolerancia de masa de fragmento de 0,1 Da. Las búsquedas de Sequest HT también incluyeron el nodo detector de precursores del software PD para identificar espectros MS/MS que contienen picos de más de un precursor. Las búsquedas de Sequest HT incluyeron una modificación fija de carbamidometilo en Cys y las modificaciones variables de oxidación en Met y pérdida de Met en el extremo N de una proteína (requerida para usar el nodo de puntuación INFERYS). Las coincidencias de péptidos identificadas por Sequest HT se sometieron a una nueva puntuación de INFERYS para optimizar aún más la cantidad de péptidos identificados con alta confianza.

Las búsquedas de mascotas incluyeron las siguientes modificaciones dinámicas además de la modificación fija de Cys alquilada por yodoacetamida (carbamidometilada): oxidación de Met, acetilación de la proteína N-terminal, ciclación de un péptido N-terminal Gln a piro-Glu y desamidación de Residuos de Asn/Gln.

Las identificaciones de proteínas se informaron con una tasa de descubrimiento falso del 1 % (confianza alta) o con una tasa de descubrimiento falso del 5 % (confianza media) según búsquedas en bases de datos señuelo que utilizan los mismos parámetros que antes. El software hizo coincidir los picos de péptidos en todas las series, y las cantidades de proteína son la suma de todas las intensidades de péptidos asociadas con la proteína.

Realizamos análisis de componentes principales para los genotipos después de la poda utilizando el parámetro '--pca' en PLINK. Los vectores propios se utilizaron para trazar. Para los datos del transcriptoma, primero obtuvimos los datos estabilizados de la variante utilizando la función 'vst' del paquete R 'DESeq2'. A continuación, calculamos los componentes utilizando la función 'plotPCA' en R. Para los datos de proteínas, promediamos los valores de cada duplicado técnico y utilizamos estos valores como entrada para la función 'prcomp' en R.

Después del filtrado, se utilizaron 575.053 genotipos de 22 animales para el análisis de asociación realizado en PLINK60 mediante la prueba exacta de Fisher. Ajustamos los valores nominales de P para corregir pruebas de hipótesis múltiples utilizando el procedimiento de permutación adaptativa71 en PLINK60. La asociación del locus se infirió en alfa = 1 × 10−5, según lo informado por The Wellcome Trust Case Control Consortium72 para estudios de casos y controles, así como por análisis previos de GWAS de rasgos reproductivos en vacas o novillas4,25,32, que correspondieron a un valor de P ajustado <0,005.

Comparamos la abundancia de transcripciones entre muestras de cada raza y cada grupo de fertilidad. Para realizar los análisis se utilizaron los paquetes R 'edgeR'73,74, con la prueba de cuasi verosimilitud, y 'DEseq2'75, utilizando la prueba de Wald y de verosimilitud. Ajustamos los valores de P sin procesar para la prueba de hipótesis múltiples calculando la tasa empírica de descubrimiento falso (eFDR76), con 10,000 permutaciones. Las diferencias en la abundancia de transcripciones se consideraron estadísticamente significativas cuando eFDR <0,002 en los resultados obtenidos de las tres pruebas.

Para identificar una abundancia diferencial de proteínas que sea sólida para el algoritmo utilizado, analizamos los datos de proteínas utilizando dos algoritmos diferentes. Primero, transformamos los datos de proteínas usando logaritmo natural (Loge(x)). Analizamos los datos transformados utilizando un modelo mixto generalizado77 utilizando el paquete R 'lme4', que incluía el grupo de fertilidad (Fértil o Subfértil), la raza (Angus o Holstein) y el efecto aleatorio del sujeto. El efecto aleatorio se incluyó en este análisis ya que las muestras se analizaron dos veces para proporcionar una estimación más sólida de la abundancia diferencial de proteínas. Luego, utilizamos la función 'emmeans', que prueba la importancia de la diferencia (H0:μ1 = μ2, H1:μ1≠μ2) con la prueba t de Student78, para calcular las diferencias estimadas en la abundancia de proteínas entre los grupos de fertilidad dentro de cada raza. . También analizamos los datos transformados logarítmicamente utilizando el paquete R 'limma'79. Tomamos en cuenta las mismas variables independientes mencionadas anteriormente (grupo de fertilidad y raza), además de tener en cuenta la correlación entre los datos duplicados de cada individuo con la función 'duplicateCorrelation'. Probamos la abundancia diferencial de las proteínas identificadas utilizando las estadísticas empíricas de Bayes implementadas en la función 'eBayes'80,81. En ambos análisis, ajustamos los valores de P nominales utilizando FDR82. Se asumió significancia si FDR < 0,05 en ambos enfoques.

Analizamos los conjuntos de datos multiómicos multimodales (genoma, transcriptoma y proteoma) de forma interactiva utilizando el enfoque de análisis de factores multiómicos83,84. Subdividimos los datos de genotipos, transcriptomas y proteomas para reducir el perfil global. Mantuvimos SNP con un valor de P <0,001 para la prueba de Fisher, genes con un valor de P <0,01 para las tres pruebas estadísticas empleadas y proteínas con un valor de P <0,05 en ambas pruebas estadísticas utilizadas. Realizamos el análisis utilizando el paquete R 'MOFA2'83,84, teniendo en cuenta la raza como grupo.

Seleccionamos 22 novillas Bos taurus de las razas Angus (n = 12) y Holstein (n = 10) en función de su aptitud para la fertilidad (Fig. 1A). Aislamos el ARN total de los glóbulos blancos circulantes, con un promedio de 16,3 µg ± 4,0, y la calidad, medida por el RIN, con un promedio de 9,4 ± 0,4. La extracción de ADN genómico arrojó 1,1 µg ± 0,4. Produjimos datos de secuenciación de ARN (Fig. 1B) y cuantificamos la abundancia de transcripción de 12,445 genes (12,105 genes codificadores de proteínas, 228 ARN largos no codificantes y 112 pseudogenes). También analizamos 575.053 posiciones de nucleótidos en todo el genoma bovino (Fig. 1B). Por último, produjimos datos proteómicos no específicos del plasma que dieron como resultado la cuantificación relativa de 213 proteínas. Como se esperaba, los datos genotípicos y proteómicos agruparon por separado a las novillas con diferentes antecedentes genéticos (Fig. 1A). Por el contrario, no hubo agrupación de las muestras según los datos del transcriptoma de los glóbulos blancos periféricos (Fig. 1D, E).

Resumen de los datos producidos. (A) Razas y clasificación utilizadas en este estudio, incluido el tamaño de la muestra. (B) Esquemas de los datos producidos y análisis realizados. Análisis de componentes principales de los datos del proteoma de polimorfismos de un solo nucleótido (C), transcriptoma (D) y (E) de todo el genoma. GWAS: análisis de asociación de todo el genoma, DGE: expresión génica diferencial, DPA: abundancia diferencial de proteínas.

Nuestro análisis identificó dos SNP significativamente asociados con la fertilidad de las novillas (rs110918927, chr12: 85648422, P = 6,7 × 10-7; y rs109366560, chr11:37666527, P = 2,6 × 10-5, Fig. 2A, archivo adicional 3). Para el SNP rs110918927, todas las novillas que parieron un ternero después de una inseminación artificial presentaron el genotipo AA (f(A) = 1, f(G) = 0), mientras que 11 de 12 novillas clasificadas como subfértiles presentaron al menos un copia del alelo G (f(A) = 0,29, f(G) = 0,71). Este polimorfismo se encuentra en una región intergénica del genoma con el gen más cercano ubicado a > 73 kilobases aguas abajo en relación con el SNP. Para el SNP rs109366560, ninguna de las novillas clasificadas como subfértiles fue homocigota para el alelo G (f(G) = 0,12, f(A) = 0,88), y cinco de las nueve novillas fértiles genotipadas fueron homocigotas GG (f (G) = 0,78, f(A) = 0,22). Este SNP se encuentra en el intrón 22 del gen de la proteína asociada a microtúbulos del equinodermo como 6 (EML6).

Análisis de asociación de todo el genoma de la fertilidad en novillas lecheras y de carne. (A) Gráfico de Manhattan con la distribución de SNP en su genoma y sus valores de P de la prueba de asociación exacta de Fisher. (B) Frecuencias genéticas de los dos SNP que supuestamente están relacionados con la fertilidad en novillas.

A continuación, intentamos determinar si había diferencias en la abundancia de transcripciones de los glóbulos blancos circulantes entre los grupos de novillas fértiles y subfértiles, teniendo en cuenta sus antecedentes genéticos. Identificamos dos genes cuya abundancia de transcripción difería (eFDR ≤ 0,002) entre los dos grupos (fértil y subfértil), a saber, la proteína asociada a la membrana plasmática de adipocitos (APMAP, 1,16 mayor abundancia en el grupo fértil) y la cadena intermedia axonemal 7 de dineína (DNAI7). , 1,23 mayor abundancia en el grupo Sub-Fértil) (Fig. 3A, archivo adicional 4).

Transcripción diferencial y abundancia de proteínas asociadas con la fertilidad. (A) Abundancia de transcripciones. (B) Abundancia de proteínas. En cada parcela, dentro de cada raza, las formas indican el mismo animal.

También probamos si había abundancia diferencial de proteínas presentes en el plasma de novillas clasificadas según sus grupos de fertilidad en ambos orígenes genéticos. La proteína dioxigenasa FTO dependiente de alfa-cetoglutarato fue más abundante en el plasma recolectado de novillas fértiles en comparación con sus contrapartes subfértiles (FDR <0,05, Fig. 3B, archivo adicional 5).

Cuando cada dato se evaluó de forma independiente, la cuantificación de las abundancias relativas de 22 y 23 genes y proteínas representó el 44,1% y el 16,6% de la varianza asociada con la clasificación de fertilidad, respectivamente, y la información genotípica de 59 SNP explicó el 70,1% de la varianza asociada con clasificación de fertilidad. En general, se identificaron cuatro factores en el análisis con el potencial de distinguir las muestras en función de su estado de fertilidad, de los cuales tres fueron los más representativos y los factores uno, dos y tres estuvieron dominados principalmente por datos de genotipo, transcripción y proteínas. respectivamente (Fig. 4A). Los factores uno, dos y tres separaron la mayoría de las muestras según su clasificación de fertilidad, excepto dos, tres y cinco muestras, respectivamente (Fig. 4B).

Análisis multiómicos de la fertilidad de novillas. (A) Porcentaje de varianza explicada por cada factor dentro de cada modalidad de datos. (B) Separación relativa de muestras según su fenotipo para cada factor trazado. (C) El peso relativo de importancia de las diez características principales (los identificadores de SNP provienen de la anotación de la matriz, los identificadores de genes son de Ensembl, los identificadores de proteínas son de UniProt) en cada modalidad de datos y factor trazado. (D) agrupación de muestras utilizando los tres modos de datos.

En particular, los nueve SNP principales que explicaron la mayor parte de la variación relacionada con el factor uno están ubicados en una ventana en el cromosoma 5 que abarca desde el nucleótido 118332762 al 118345383. El décimo SNP fue el polimorfismo más significativo identificado en el nucleótido 85648422 del cromosoma 12 según nuestro método exacto de Fisher. Pruebe novillas contrastantes con diferente potencial de fertilidad (Fig. 4C). Entre los genes cuya abundancia de transcripción explicó la varianza relacionada con el factor dos, identificamos los siguientes genes anotados: ArfGAP con dominio SH3, repetición de anquirina y dominio PH 3 (ASAP3), subunidad c de membrana de ATP sintasa locus 1 (ATP5MC1), proteína centrosomal 170 (CEP170), factor de crecimiento derivado de mieloide (MYDGF), dominio en espiral que contiene 34 (CCDC34), proteína 1 asociada a RAD51 (RAD51AP1) y subunidad VII del complejo III de ubiquinol-citocromo c reductasa (UQCRQ) (Fig. 4C). Entre las proteínas cuya abundancia explicaba la varianza relacionada con el factor tres, las siguientes estaban anotadas en genes conocidos: apolipoproteína C-II (APOC2), proteína citosólica de linfocitos 1 (LCP1), proteína Z dependiente de vitamina K (PROZ), albúmina (ALB ), similar a la serotransferrina (LOC525947), componente del complemento de la cadena beta C8 (C8B), factor derivado del epitelio pigmentario (SERPINF1), fosfatidilinositol-glicano fosfolipasa D específica (GPLD1), dioxigenasa FTO dependiente de alfa-cetoglutarato (FTO) (Fig. .4C). En conjunto, los datos de los genotipos, el transcriptoma y el proteoma agruparon correctamente a 21 de 22 novillas según su estado de fertilidad, y solo una novilla fértil se agrupó con el grupo de novillas subfértiles.

La reproducción es una función biológica multidimensional en los mamíferos que puede dividirse en múltiples componentes o rasgos85 y, como consecuencia, la infertilidad es un fenotipo complejo con orígenes multifactoriales, incluido un fuerte componente genético53,54. Nuestro estudio no fue diseñado para identificar marcadores moleculares para uso futuro en programas de selección. Más bien, nuestro trabajo abordó dos preguntas críticas sobre la biología subyacente de la infertilidad: (a) si las múltiples capas de información molecular, presentes en el sistema circulatorio, diferirían según la capacidad de fertilidad femenina; y (b) si el análisis integrador de múltiples capas de información molecular sería un mejor predictor de las causas de la infertilidad. Nuestro análisis identificó firmas moleculares en el genoma, el transcriptoma y el proteoma que brindan información importante sobre las causas fundamentales de la infertilidad.

Ninguno de los SNP significativos estaba ubicado en una región previamente asociada con rasgos reproductivos femeninos86. Tampoco se ha informado anteriormente que estos SNP estén asociados con rasgos de fertilidad en investigaciones anteriores que se centraron en modelos centrados en el toro4,33,34,35,36,37, ni en estudios que se centraron en novillas genotipadas únicamente32,38. Sin embargo, llama la atención que el polimorfismo rs110918927 se encuentra en el gen EML6, que produce una proteína que participa en la función de los microtúbulos del huso en los ovocitos87. La eliminación de esta proteína en ovocitos de ratones en la etapa de vesícula germinal altera la morfología del huso y aumenta la aneuploidía87 en ovocitos que progresan a la etapa de metafase II en ausencia de EML688. El gen EML6 también produce transcripciones en ovocitos bovinos89, y el SNP significativo en este gen es una fuerte indicación de una conexión funcional con una competencia de desarrollo de ovocitos reducida en el grupo de novillas subfértiles.

Los genes expresados ​​diferencialmente en los glóbulos blancos periféricos se han asociado con la fertilidad en novillas39,40,41. La proteína APMAP exhibe actividad arilesterasa, que se sabe que protege a las lipoproteínas de la oxidación90. Es importante destacar que la proteína APMAP regula la composición adiposa y la salud metabólica, y la alteración del gen APMAP en ratones conduce a un aumento en la expansión del tejido adiposo visceral91. También se demostró que esta proteína es menos abundante en el tejido omental de mujeres diagnosticadas con síndrome de ovario poliquístico92. Por lo tanto, la menor expresión de APMAP en los glóbulos blancos periféricos de las novillas subfértiles posiblemente esté relacionada con un trastorno metabólico, hormonal o inflamatorio que altera la fertilidad en las novillas.

La proteína DNAI7 compone el complejo axonemal de dineína y participa en la actividad de unión de beta-tubulina y de microtúbulos y, por lo tanto, contribuye al latido ciliar93. Las variantes que alteran la función de DNAI7 están asociadas con la discinesia ciliar primaria, siendo una posible consecuencia la función anormal de los cilios y la posible alteración del transporte de los embriones en escisión hacia el útero94. DNAI7 también puede funcionar como regulador del ciclo celular, y la abundancia desregulada de la transcripción de DNAI7 se asoció con neoplasia nasofaríngea en ratones95 y adenocarcinoma de pulmón en humanos96. Dado que las novillas subfértiles tienen una mayor abundancia de transcripciones de DNAI7 en sus glóbulos blancos circulantes, es posible que la desregulación en el ciclo celular tenga un vínculo biológico con la subfertilidad. Sin embargo, se requiere más investigación para evaluar si una desregulación en el ciclo celular relacionada con la regulación positiva de DNAI7 está relacionada con una mayor inflamación91 asociada con menos transcripciones de APMAP.

La proteína dioxigenasa FTO dependiente de alfa-cetoglutarato tiene actividad de desmetilación oxidativa de abundantes residuos de N6-metiladenosina (m6A) en el ARN97. La proteína FTO desmetila preferentemente la N6,2′-O-dimetiladenosina (m6Am) en lugar de la m6A y contribuye a una estabilidad reducida de los ARNm de m6Am98. A nivel sistémico, las variantes genómicas en FTO se asociaron con síntomas de trastornos metabólicos99, aunque los efectos observados en humanos, como el índice de masa corporal elevado100,101 y ratones102, pueden ser contradictorios. También cabe destacar que una variante del gen FTO se asoció con el síndrome de ovario poliquístico103. Curiosamente, en ratones, el gen FTO está regulado negativamente debido a una deficiencia de aminoácidos esenciales104, y la deficiencia en la proteína FTO provoca un retraso del crecimiento posnatal y una reducción significativa del tejido adiposo y la masa corporal magra105. Nuestra observación de la abundancia de FTO en novillas con diferente potencial de fertilidad es una indicación de que las novillas subfértiles podrían estar experimentando un desequilibrio metabólico, lo que contribuye a su menor fertilidad. Observamos que las novillas utilizadas en este experimento no fueron desafiadas nutricionalmente y, por lo tanto, nuestras observaciones son una consecuencia de su sistema biológico intrínseco y de cómo este puede utilizar los nutrientes.

El siguiente paso fue interrogar los datos que produjimos de manera integral. Curiosamente, la mayor fuente de variabilidad se observó en los datos genómicos. Nueve de los diez SNP principales que se asignaron al factor uno se ubicaron en un intrón del gen TAFA5 (miembro 5 de la familia similar a la quimiocina TAFA). Estos SNP se encuentran dentro de un loci de rasgo cuantitativo para la producción de leche106, un rasgo correlacionado negativamente con los rasgos reproductivos107; sin embargo, no se ha informado anteriormente de ninguna relación entre las variantes genéticas en este gen y la fertilidad femenina. Ninguno de los diez genes principales con abundancia de transcripciones relevantes para el modelado de la varianza se identificó como expresado diferencialmente cuando se analizó de forma independiente. Este resultado no es sorprendente porque la identificación de características significativas utilizando enfoques estadísticos estándar para el análisis de asociación no es necesariamente el mejor enfoque para identificar genes predictivos asociados con rasgos complejos108,109. Fue sorprendente que tres de las nueve proteínas anotadas, que componían las diez proteínas principales que explicaban la mayor parte de la varianza en el factor tres, también se identificaron en nuestros análisis utilizando modelos lineales mixtos generales. Sin embargo, el resultado más interesante fue que las tres modalidades de datos pudieron separar correctamente 21 de 22 novillas en función de su potencial de fertilidad. Nuestros resultados muestran que las diferencias moleculares tienen fuertes señales relacionadas con la capacidad de fertilidad que supera sus diferentes antecedentes genéticos.

Nuestro interrogatorio de múltiples niveles de información biológica (genoma, transcriptoma y proteoma) a nivel sistémico en novillas destacó la complejidad molecular de la fertilidad femenina. Si bien los datos genómicos apuntaron a una alteración de la competencia del desarrollo de los ovocitos, los datos transcriptomas y proteómicos apuntan a una desregulación metabólica que contribuye a la subfertilidad o la infertilidad. Aunque las diferencias en los perfiles moleculares identificadas en nuestro estudio deben validarse aún más mediante estudios mecanicistas, nuestros resultados, respaldados por la literatura actual, resaltan diferencias en el perfil molecular asociado con la fertilidad femenina que trascienden las limitaciones de los antecedentes genéticos específicos de la raza.

Los datos del transcriptoma y proteoma generados y analizados durante el estudio actual están disponibles en los repositorios Gene Expression Omnibus y ProteomeXchange con los siguientes identificadores: GSE220220 y PXD038756, respectivamente. Los datos genotípicos están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

microgramo

Inseminación artificial

Albúmina

Proteína asociada a la membrana plasmática de los adipocitos

Apolipoproteína C-II

ArfGAP con dominio SH3, repetición de anquirina y dominio PH 3

Subunidad c de membrana de ATP sintasa locus 1

Componente del complemento cadena beta C8

Dominio en espiral que contiene 34

Proteína centrosómica 170

Liberación interna controlada de fármacos.

Cuentas por millón

Cadena intermedia axonemal de dineína 7

ditiotreitol

Expresión genética diferencial

Abundancia diferencial de proteínas

Tasa empírica de descubrimiento falso

Proteína asociada a microtúbulos de equinodermo como 6

Tasa de falso descubrimiento

Fragmentos por kilobase por millón

Dioxigenasa FTO dependiente de alfa-cetoglutarato

Hormona liberadora de gonadotropina

Fosfolipasa D específica de fosfatidilinositol-glicano

Estudio de asociación de todo el genoma

Ácido indol-3-acético

Comité institucional de cuidado y uso de animales.

intramuscular

Ácido etilendiaminotetraacético dipotasico

Proteína citosólica de linfocitos 1

Similar a la serotransferrina

Molar

N6-metiladenosina

N6mena2′-O-dimetiladenosina

Miligramo

Minutos

Mililitro

ARN mensajero

Milisegundo

Factor de crecimiento derivado de mieloide

nanogramo

Nanómetro

Nanolitros

Probabilidad

Prostaglandina F2 alfa

Proteína Z dependiente de vitamina K

Proteína 1 asociada a RAD51

número de integridad del ARN

Factor derivado del epitelio pigmentario

Polimorfismo de nucleótido simple

Miembro 5 de la familia similar a la quimiocina TAFA

Subunidad VII del complejo III de ubiquinol-citocromo c reductasa

Incubadora de espectrometría de masas de Virginia Tech

Fuerza centrífuga relativa

Microlitro

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Expresamos nuestro agradecimiento a Chad Joines, director de operaciones de ganado vacuno, a Shane Brannock, director del complejo lechero, y a sus respectivos equipos por apoyar nuestro muestreo. También agradecemos a Jada Nix de nuestro grupo por la lectura crítica de nuestro manuscrito.

Los autores agradecen la financiación del Consejo de Agricultura de Virginia, la Junta de la Industria Ganadera de Virginia y la Asociación Láctea del Estado de Virginia. Este proyecto fue parcialmente apoyado por la Subvención Competitiva de la Iniciativa de Investigación Agrícola y Alimentaria no. 2020-67015-31616 del Instituto Nacional de Alimentación y Agricultura del USDA. Las instituciones de financiación no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio y la recopilación, análisis e interpretación de los datos ni en la redacción del manuscrito.

Facultad de Ciencias Animales, Instituto Politécnico y Universidad Estatal de Virginia, Blacksburg, VA, EE. UU.

Mackenzie A. Marrella y Fernando H. Biase

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FB diseñó, supervisó, adquirió financiación y redactó el artículo. FB recopiló y procesó las muestras para la recopilación de datos. MM contribuyó a financiar la adquisición, el análisis y la interpretación de los datos. Todos los autores han leído y aprobado la versión enviada.

Correspondencia a Fernando H. Biase.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Marrella, MA, Biase, FH Un análisis multiómico identifica características moleculares asociadas con la fertilidad en novillas (Bos taurus). Informe científico 13, 12664 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39858-0

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Recibido: 25 de abril de 2023

Aceptado: 01 de agosto de 2023

Publicado: 04 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39858-0

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